细胞工程实验报告

细胞工程实验报告实验名称：细胞工程相关实验

实验目的：1.掌握细胞培养的基本技术，包括细胞的复苏、传代和冻存。2.学习单克隆抗体的制备方法，了解其原理和应用。3.通过细胞融合实验，观察细胞融合现象，掌握细胞融合的基本操作。4.熟悉细胞工程相关仪器设备的使用方法，提高实验操作技能。

实验材料与方法：1.实验材料细胞系：骨髓瘤细胞系SP2/0、小鼠脾细胞试剂：RPMI1640培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、青链霉素、HAT培养基、PEG（聚乙二醇）、HT培养基、小牛血清白蛋白、碱性磷酸酶标记羊抗鼠IgG抗体、对硝基苯磷酸二钠（pNPP）等。仪器设备：超净工作台、二氧化碳培养箱、倒置显微镜、离心机、细胞计数板、移液器等。2.实验方法细胞培养细胞复苏：从液氮中取出冻存的细胞，迅速放入37℃水浴中，快速晃动使其在1分钟内完全融化。然后将细胞悬液转移至含10ml完全培养基（RPMI1640培养基+10%胎牛血清+1%青链霉素）的离心管中，1000rpm离心5分钟，弃上清，加入适量完全培养基重悬细胞，接种于培养瓶中，置于37℃、5%CO₂培养箱中培养。细胞传代：当细胞生长至对数生长期，细胞密度达到80%90%融合时，进行传代。吸弃培养瓶中的旧培养基，用PBS洗涤细胞2次，加入适量胰蛋白酶溶液，使胰蛋白酶覆盖整个细胞表面，在37℃培养箱中消化12分钟，显微镜下观察细胞变圆、间隙增大时，立即加入含血清的完全培养基终止消化。用移液器轻轻吹打细胞，使其分散成单细胞悬液，然后按照1:2或1:3的比例接种到新的培养瓶中，加入适量完全培养基，置于培养箱中继续培养。细胞冻存：选择生长状态良好的细胞，吸弃培养基，用PBS洗涤细胞2次。加入适量胰蛋白酶溶液进行消化，待细胞变圆后，加入含血清的完全培养基终止消化，将细胞悬液转移至离心管中，1000rpm离心5分钟，弃上清。加入适量冻存液（90%胎牛血清+10%DMSO），轻轻吹打均匀，将细胞悬液分装至冻存管中，每管1ml左右。将冻存管放入程序降温盒中，置于80℃冰箱过夜，然后转移至液氮罐中长期保存。单克隆抗体的制备动物免疫：选取68周龄的BALB/c小鼠，腹腔注射50μg抗原（预先用PBS稀释），免疫间隔为2周，共免疫3次。末次免疫后3天，颈椎脱臼处死小鼠，无菌取出脾脏。脾细胞悬液的制备：将取出的脾脏置于盛有RPMI1640培养基的培养皿中，用镊子轻轻撕开脾脏，使其分散成单个细胞，然后用吸管将细胞转移至离心管中，1000rpm离心5分钟，弃上清，加入适量RPMI1640培养基重悬细胞，制成脾细胞悬液。细胞融合：取对数生长期的骨髓瘤细胞SP2/0，用RPMI1640培养基洗涤2次，1000rpm离心5分钟，弃上清，制成骨髓瘤细胞悬液。将脾细胞悬液和骨髓瘤细胞悬液按照10:1的比例混合于离心管中，1000rpm离心5分钟，弃上清。用手指轻弹离心管底部，使细胞沉淀松散，然后在37℃水浴中预热50%PEG溶液，缓慢逐滴加入到细胞沉淀中，边加边轻轻晃动离心管，持续作用1分钟。立即加入10mlRPMI1640培养基，终止PEG作用，1000rpm离心5分钟，弃上清。HAT培养基筛选：加入适量HAT培养基重悬细胞沉淀，将细胞悬液接种于96孔培养板中，每孔100μl，置于37℃、5%CO₂培养箱中培养。每隔23天更换一次HAT培养基，观察细胞生长情况。阳性杂交瘤细胞的筛选：待杂交瘤细胞生长至孔底面积的1/31/2时，用ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞。具体操作如下：用包被缓冲液稀释抗原，包被96孔酶标板，每孔100μl，4℃过夜。弃包被液，用PBST缓冲液洗涤酶标板3次，每次3分钟。加入封闭液，每孔200μl，37℃封闭1小时。弃封闭液，用PBST缓冲液洗涤酶标板3次，每次3分钟。取培养上清加入到相应孔中，每孔100μl，37℃孵育1小时。弃上清，用PBST缓冲液洗涤酶标板3次，每次3分钟。加入碱性磷酸酶标记羊抗鼠IgG抗体，每孔100μl，37℃孵育1小时。弃上清，用PBST缓冲液洗涤酶标板3次，每次3分钟。加入底物pNPP溶液，每孔100μl，室温避光显色1530分钟。加入2MNaOH溶液终止反应，每孔50μl，用酶标仪在405nm波长处测定吸光度值。选择OD值较高的孔所对应的细胞进行克隆化培养。克隆化培养：采用有限稀释法对阳性杂交瘤细胞进行克隆化培养。将阳性杂交瘤细胞制成单细胞悬液，用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基稀释成不同浓度，使每孔含0.51个细胞，接种于96孔培养板中，每孔100μl，置于37℃、5%CO₂培养箱中培养。待孔中出现细胞克隆后，按照上述ELISA方法筛选阳性克隆，直至获得稳定分泌特异性抗体的单克隆杂交瘤细胞株。单克隆抗体的大量制备：将筛选出的阳性单克隆杂交瘤细胞株接种于BALB/c小鼠腹腔，每只小鼠接种1×10⁶个细胞。710天后，小鼠腹腔出现腹水，用无菌注射器抽取腹水，离心去除细胞碎片，收集上清，即为单克隆抗体粗制品。然后通过硫酸铵沉淀、离子交换层析、亲和层析等方法进一步纯化单克隆抗体。细胞融合的观察在倒置显微镜下观察细胞融合过程，记录不同时间点细胞的形态变化，如细胞开始融合、形成双核细胞、多核细胞等情况。融合后的细胞培养24小时后，用姬姆萨染色法对细胞进行染色，观察融合细胞的形态结构，并计算细胞融合率。细胞融合率=（融合细胞数/总细胞数）×100%

实验结果：1.细胞培养细胞复苏：复苏后的细胞在24小时内开始贴壁生长，48小时后细胞形态逐渐恢复正常，呈圆形或椭圆形，细胞生长状态良好。细胞传代：传代后的细胞在24小时内贴壁，继续培养23天后，细胞进入对数生长期，细胞密度逐渐增加。细胞冻存：冻存后的细胞复苏后生长状态良好，表明冻存方法有效。2.单克隆抗体的制备动物免疫：经过3次免疫后，小鼠脾脏明显肿大，表明免疫效果良好。细胞融合：融合后的细胞在HAT培养基中培养23天后，部分细胞开始生长，形成小的细胞集落。阳性杂交瘤细胞的筛选：通过ELISA筛选，共获得10株阳性杂交瘤细胞株，其OD值均高于阴性对照。克隆化培养：经过3次有限稀释法克隆化培养，最终获得3株稳定分泌特异性抗体的单克隆杂交瘤细胞株。单克隆抗体的大量制备：接种单克隆杂交瘤细胞株的小鼠腹腔出现大量腹水，收集腹水后经初步纯化，获得了一定量的单克隆抗体粗制品。进一步纯化后，得到了纯度较高的单克隆抗体，经SDSPAGE电泳分析，其分子量约为150kD。3.细胞融合的观察在倒置显微镜下观察到细胞融合过程，细胞开始融合后逐渐形成双核细胞、多核细胞。融合后的细胞在培养24小时后，用姬姆萨染色法染色，观察到融合细胞形态结构正常，细胞融合率为20%左右。

实验讨论：1.细胞培养在细胞复苏过程中，要注意快速融化细胞，避免细胞受到损伤。同时，复苏后的细胞应尽快接种到培养瓶中，并给予适当的培养条件，以促进细胞的生长。细胞传代时，胰蛋白酶的消化时间不宜过长，以免过度消化导致细胞死亡。消化后的细胞应及时用含血清的培养基终止消化，并轻轻吹打均匀，以保证细胞的活性。细胞冻存时，冻存液的配制和冻存程序对细胞的存活率有重要影响。DMSO的浓度过高会对细胞产生毒性，过低则起不到保护作用。因此，要严格按照操作规程配制冻存液，并采用程序降温的方法进行冻存，以提高细胞的冻存效果。2.单克隆抗体的制备动物免疫是制备单克隆抗体的关键步骤之一，免疫效果直接影响到脾细胞的质量和抗体的产量。在免疫过程中，要注意抗原的剂量、免疫间隔时间和免疫途径等因素，以获得高效价的免疫血清。细胞融合是制备单克隆抗体的核心环节，PEG的浓度和作用时间对细胞融合率有重要影响。过高的PEG浓度会导致细胞毒性增加，过低则融合率降低。因此，要根据细胞类型和实验要求，选择合适的PEG浓度和作用时间，并在操作过程中注意轻柔，避免对细胞造成损伤。阳性杂交瘤细胞的筛选是制备单克隆抗体的重要步骤，ELISA方法是一种常用的筛选方法。在筛选过程中，要注意抗原的包被浓度、封闭液的选择、抗体的稀释度和底物的显色时间等因素，以确保筛选结果的准确性。克隆化培养是获得稳定分泌特异性抗体的单克隆杂交瘤细胞株的关键步骤，有限稀释法是一种常用的克隆化方法。在克隆化培养过程中，要注意细胞的稀释度和接种密度，以保证每个孔中只有一个细胞生长，从而获得单克隆细胞株。3.细胞融合的观察细胞融合过程中，不同细胞系的融合率可能会有所不同，这与细胞的类型、生理状态和培养条件等因素有关。在实验中，我们观察到细胞融合率约为20%，可能需要进一步优化实验条件，如调整PEG的浓度和作用时间、选择合适的细胞比例等，以提高细胞融合率。姬姆萨染色法是一种常用的细胞染色方法，可以清晰地观察到细胞的形态结构。在染色过程中，要注意染色液的浓度、染色时间和冲洗时间等因素，以保证染色效果。

实验结论：通过本次细胞工程实验，我们成功掌握了细胞培养的基本技术，包括细胞的复苏、传代和冻存。同时，学习了单克隆抗体的制备方法，通过动物免疫、细胞融合、阳性杂交瘤细胞筛选、克隆化培养和单克隆抗体的大量制备等步骤，最终获得了3株稳定分泌特异性抗体的单克隆杂交瘤细胞株，并制备了一定量的单克隆抗体。此外，通过细胞融合的观察实验，我们观察到了细胞融合现象，并计算了细胞融合率。实验结果表明，我们所采用的实验方法和技术路线是可行的，为进一步开展细胞工程相关研究奠定了基础。

注意事项：1.实验操作应在超净工作台中进行，严格遵守无菌操作规程，防止细胞污染。2.所有试剂和培养基应在使用前进行预热，以保证细胞的生长环境适宜。