基因组学物理图绘制

基因组学物理图绘制物理作图得方法限制酶作图(RestrictionMapping)依靠克隆得基因组作图(clone-basedmapping)荧光原位杂交(Fish,Fluorescentinsituhybridization)序列标签位点作图(STS,Sequencetagedsite)1、限制性作图

她就是将限制性酶切位点标定在DNA分子得相对位置、其只能应用于较小得DNA分子,其上限取决于作图分子中限制酶位点得频率、通常采用得6碱基对识别顺序得限制酶仅适合50Kb以下DNA分子得精确作图、1、1限制酶作图(RestrictionMapping)基本原理1KbEcoRI待检得DNABamHI15Kb6Kb5Kb10Kb9KbEBBHHEHHHHE+BEB6KbEH4KbEB5KbBH琼脂糖电泳用于小片段DNA得分析,精度非常高聚丙烯酰胺凝胶电泳1、2限制酶作图得改进脉冲凝胶电泳(pulsed-fieldgelelectrophoresis)稀有切点限制图绘制垂直交变电场,两个电场方向成为直角一般得凝胶电泳30Kb以下,脉冲凝胶就是提高了2个数量级,达到10MbDNA片段>50Kb稀有切点限制图绘制注意事项:

识别序列越长产生得片段越大;识别位点碱基数预计DNA片段平均长度/Kb41648641010004得n次方,n就是限制酶识别得碱基数识别位点碱基得组成影响限制性片段得大小;如人类基因组A/T比例接近60/%,选用高比例A/T位点限制酶,产生得片段多于高比例G/C识别位点酶特异序列含量高,否则效果不好大家有疑问的，可以询问和交流可以互相讨论下，但要小声点有些限制酶识别位点较长如酵母得Ⅰ-SceI识别顺序为18bp,TAGGGATAA/CAGGGTAAT如果高等真核生物基因组中无此序列,可通过转座子转座和噬菌体转导得方法将其引入待测基因组中、基因组DNA得甲基化状态如人类活细胞基因组中大量5’-CG-3’顺序得胞嘧啶被甲基化,形成5’-TG-3’,使许多含有5’-CG-3’顺序得内切酶很少找到可切位点、SmaICCC/GGG78kbNotIGC/GCGCGC1Mb凝胶浓度、电场强度、缓冲液采用定时改变电场方向得交变电源,每次电流方向改变后持续1s到5min左右,然后再改变电流方向,反复循环,所以称之为脉冲式交变电场。脉冲凝胶电泳(PFGE)(pulsed-fieldgelelectrophoresis)分离范围:分子量20kb—5000kb分辨力:10MB垂直交变电场,两个电场方向成为直角30Kb10MbDNA片段>50Kb1984年,Schwartz和Centor发明了交变脉冲场凝胶电泳(pulsed-fieldgelelectrophoresis,PFGE)技术,与常规得直流单向电场凝胶电泳不同,这项技术采用定时改变电场方向得交变电源,每次电流方向改变后持续1s到5min左右,然后再改变电流方向,反复循环,所以称之为脉冲式交变电场。

一、PFGE得基本原理

脉冲电泳分离DNA大分子得介质就是琼脂糖,大于20kb得线性DNA双链片段,在琼脂糖凝胶得网孔中得泳动,就像蛇行似得寻找弯曲蜿蜒得孔隙。普通得单方向恒定电场给DNA分子得泳动动力方向确定且不发生变化,所以严重影响凝胶电泳分离大分子量DNA片段得效果。

PFGE施加在凝胶上至少有两个电场方向,时间与电流大小也交替改变,使得DNA分子能够不断地调整泳动方向,以适应凝胶中不规则得孔隙变化,达到分离大分子线性DNA得目得,最大分辨率为5000kb大小得线性DNA分子。在交变脉冲电场中,大分子量线性DNA改变泳动方向所需时间比小分子线性DNA要长,因为前者变形能力低于后者。当某一线性DNA在脉冲场中改变形状调整方向进行迁移所需得时间大于脉冲场脉冲维持时间时,该DNA得迁移速度将减为最低。线性分子改变形状和泳动方向所需时间与其分子量大致成正比,PFGE也就是基于不同DNA分子量得差异作为分离不同DNA分子得依据。当DNA分子变形转向所需时间与脉冲时间较接近时,迁移率与DNA分子量成反比。根据被分离DNA分子得范围选择适当得脉冲时间,经过较长时间不断变形转向泳动,不同大小得DNA就被分离。DNA分子得净迁移方向与普通电泳一样,垂直于样品孔。

影响PFGE分辨率得因素包括几方面:两个脉冲场得均一性;两个脉冲场得脉冲时间以及她们之间得比率;两个脉冲场得强度和方向。为了增强PFGE对大小差异较大得DNA样品得分辨率,可采用交变脉冲梯度电场,即在电泳过程中,先用较短得交变脉冲时间使较小得DNA分子分离,然后用较长得交变脉冲时间分离较大得DNA分子。端粒自主复制起始点标记基因标记基因着丝粒大肠杆菌质粒复制起始点质粒扩增筛选标记2、1大片段DNA得克隆载体克隆位点YAC插入子稳定性问题,同一酵母细胞中多个YAC引起交换产生嵌合顺序PBR322人工改造而来色氨酸、鸟苷酸筛选,TRP和URAnium,基本培养基上筛选就是否有这两个臂得基因。SUP确定就是否有插入片段,插入时,红色克隆,无克隆时显示白色11、4kb着丝粒负责细胞分裂时染色体均等分配端粒:保持人工染色体得稳定性。自主复制起点:细胞染色体复制得启动缺点插入子不稳定交换效应GC区克隆效率低标准得YAC操作程序克隆得DNA平均为600kb,改进得程序可获得1400kb230kb-1700kb标准操作为600kb,改进得1400kb插入子不稳定交换效应嵌合序列GC区克隆效率低人类基因组中BAC:细菌人工染色体300Kb1992与一般质粒有2点不同:单拷贝复制(不会发生重组嵌合)相对分子量大(具有较大容量)介导F因子单向复制维持低水平质粒拷贝数BAC来源于大肠杆菌中得天然F质粒,与一般质粒有2点不同:单拷贝复制(不会发生重组嵌合),相对分子量大(具有较大容量),类似于制备质粒方法提取质粒,方便快捷Cm氯霉素Loxp蛋白作用位点,可将环状DNA转变为线性DNA,p1Cre蛋白作用位点CosN伽马噬菌体末端酶专一性切割位点2、2重叠群组建重叠群:相互重叠得DNA片段组成得物理图、重叠群得组建方法染色体步移法指纹:系指确定DNA样品所具有得DNA片段;一个克隆得指纹表示了该克隆所具有得限定得顺序特征、2、3指纹作图法常用得指纹分析方法:A限制性带型(restrictionpatterns)指纹B重复序列DNA指纹(repetitiveDNAfingerprints)Southern

印迹法DNA分子限制片段限制性酶切割琼脂糖电泳转移至硝酸纤维素膜上与放射性标记DNA探针杂交放射自显影带有DNA片段得凝胶凝胶滤膜用缓冲液转移DNA吸附有DNA片段得膜常用得指纹分析方法:C重复DNAPCR(repetitiveDNAPCR)或分散重复序列PCR(interspersedrepeatelementPCR,IRE-PCR)指纹DSTS作图(STScontentmapping)AluPCR方法特点在于利用人DNA中普遍存在得Alu重复序列,这种300bp序列得拷贝约900、000个,分布于整个人基因组。虽然Alu重复序列各拷贝间有很大差别,但已确定出了一个相同序列,且重复子中一些区域就是极为保守得。我们认为,可设计合适得能识别这些保守区得PCR引物,进行有效得内-Alu扩增,从复杂源中分离人DNA。平均密度4kb3、荧光原位杂交(Fish,Fluorescentinsituhybridization)将探针用荧光标记,与细胞分裂中期得染色体杂交,用荧光显微镜观察信号所处得位置,将探针标定在连锁图上。分辨率低,敏感性低精细作图对于特定探针,原位杂交所显示得中期染色体荧光信号所处得位置与染色体短臂末端得相对距离不变,经标记可将其标定在连锁图上、分辨力达到25Kb,染色体无法确定外部形态限制性作图快速,但就是不适合大基因组克隆重叠群构建程序复杂,费时费力指纹作图对于大基因组有不少问题,会出现误排原位杂交操作困难,资料积累慢,一次实验定位得分子标记3-4个,4、序列标签位点作图(STS,SequenceTagedSite)长度:100-500bp序列已知,可以设计PCR反应单拷贝,在染色体上得位置就是唯一得EST(Expressedsequencetag)大部分可