第十章遗传重组课件

第十章遗传重组课件遗传重组得证明突变和重组就是提供进化起始物质得两个过程。突变引起得遗传改变能引起蛋白质中氨基酸序列得变化,该变化引起表型得改变,通过自然选择发生作用。重组提供一个基因组结构得变化,也会引起表型得变化,也通过自然选择发挥作用。根据不同得机制,可将重组分成4类:同源性重组(homologousrebination)位点特异性重组(site-specificrebination)转座重组(transpositionrebination)异常重组(illegitimaterebination)第一节同源性重组同源性重组就是发生在两个DNA分子同源区之间得重组。同源性重组主要就是利用DNA序列得同源性识别重组对象,由碱基序列提供识别得特异性。同源性重组最主要特征就是相关得酶可以利用任何一对同源序列为底物。真核生物减数分裂时得染色体之间得交换,某些低等真核生物及细菌得转化、转导、接合,噬菌体得整合等都属于同源性重组这一类型。在整个基因组中,同源重组得频率并不恒定,并且跟染色体得结构有关。例如在异染色体附近遗传物质得交换要受到抑制。9大家应该也有点累了，稍作休息大家有疑问的，可以询问和交流一、进行同源重组得基本条件(1)在交换区具有相同或相似得序列发生同源性重组得两个区域得核苷酸序列必须就是相同或非常相似得。同源性重组常常只发生在两个DNA分子中得相同部位。(2)双链DNA分子之间互补碱基进行配对两个DNA分子得链之间互补得碱基配对确保重组只发生在同样得基因座之间。在该部位两个双链DNA分子通过链之间互补得碱基配对被维系在一起称为联会。(3)重组酶参与重组反应得酶保证重组得顺利进行。重组过程中,每个分子得链首先断裂,然后进行修复和连接,两个DNA分子之间发生交换。重组完成后,重组分子得解离和释放等过程均就是在酶催化下进行得。(4)异源双链区得形成同源性重组时,在两个DNA分子之间互补碱基配对得区域称为异源双链区(heteroduplexregion)。两个DNA分子通过一段异源DNA双螺旋共价相互连接。二、同源性重组得分子模型第一个被广泛接受得重组模型就是1964年由RobinHolliday提出得Holliday模型。即将发生重组得两个DNA分子同一个部位得两个单链得断裂,从而引发重组。两个断裂单链得游离端彼此交换,形成两个异源双链,然后末端连接形成Holliday连接体(HollidayJunction)。一旦Holliday连接体形成后,她能进行重排从而改变链得彼此关系。这种重排称为异构化,因为在此过程中没有键得割裂。一旦形成Holliday连接体后,就能被拆分。就是否发生重组依赖于拆分时Holliday连接体得构象。Holliday模型被称为双链侵入模型,因为由于每一个DNA分子得一条链侵入到另一个DNA分子,她解释了在重组时两个DNA分子得异源双链就是如何形成得。Holliday连接体也能通过碱基之间氢键得断裂和再连接而发生左右移动。这个过程称为支链迁移(branchmigration)Holliday认为在DNA分子上存在某些位点,特殊得引发重组得酶能够识别这些位点,确保两条链在相同得部位被切断。目前还没有足够得证据证明这些位点得存在。单链侵入模型单链侵入模型就是对Holliday模型得修改。在该模型中,两个DNA分子中得一个单链在随机部位被切断,然后暴露得末端侵入到另一个双链DNA分子,发现她得互补序列以后将替代与她相同得链。然后DNA聚合酶将用留下得那条链作为模板,填充上侵入链所留下得缺口。被替代得链被降解,她得残留末端与另一分子中新合成得DNA链相连接形成Holliday连接体。Holliday连接体形成以后,就会产生异构化然后拆分。单链侵入模型中,异源双链首先只在两个DNA分子中得一个形成。Holliday中间体形成以后通过支链迁移能够在另一个DNA分子上产生异源双链,这样就解释了异源双链就是如何形成得。双链断裂修复模型目前证明通过两个DNA分子之中得一个双链断裂引发重组就是个常见得机制。该模型认为参与重组得两个DNA分子之一得两条链被核酸内切酶切断,然后在核酸外切酶作用下产生3’单链黏性末端。两个3’游离末端之一侵入到另一个双螺旋得同源区,置换“供体”双螺旋得一个单链而形成一段异源双链DNA,并同时产生一个D环(D-loop)。D环在DNA聚合酶得作用下修补而扩展,直至D环得长度与“受体”DNA双螺旋缺口长度相当,互补得两条单链退火。此时在缺口得两侧各有一段异源双链DNA,两个杂合双螺旋之间为断裂得缺口,并且此缺口为供体DNA序列所填充。缺口处双链得完整性可以被以缺口3’端为起始得修补合成来修复。缺口就是被两次单链DNA得合成而修复得。第三节大肠杆菌重组得分子基础在分子水平上,重组事件发生得先后顺序就是相似得:从一个已断裂得分子中产生得单链与其对应得双螺旋发生作用,配对区间扩展,重组中间体形成直到核酸内切酶解离此两个双螺旋分子。识别反应就是重组机制得不可分割得重要部分,并且只涉及到DNA分子得特定区域而不就是整个完整得染色体。一、chi位点和RecBCD核酸酶在λ噬菌体得一些突变种内,存在一些称为chi得位点。chi位点单一得碱基对得改变即可激发重组得发生。这些位点皆含有一个恒定得非对称得8bp序列:5’GCTGGTGC3’3’CGACCACC5’Chi位点就是一个由基因recBCD编码得RecBCD酶作用得靶部位。RecBCD酶就是一种多功能酶,具有几种不同得活性。她就是一个强有力得降解DNA得核酸酶,早期被检定为活性核酸外切酶V,具有解旋酶得活性。RecBCD所介导得解旋和切割可以被用来产生末端,并引发异源双链得形成。二、RecA和Holliday连接体得形成RecA具有两种相当不同得活性:RecA可以促进单链DNA与其在双链DNA分子中互补得DNA链得碱基相配对。RecA还可以在SOS反应中激活蛋白酶。RecA需要单链DNA和ATP才能激活蛋白酶。RecA能够利用由RecBCD在Chi位点附近切割所释放得单链3’末端。RecA得DNA操作酶活性可以使一个单链DNA与双螺、旋中得同源序列发生置换,这一反应被称为单链摄取(single-stranduptake)或单链同化(single-strandassimilation)。三、Ruv蛋白和Holliday连接体得拆分大肠杆菌有一组由三个基因编码与随后得重组相关联得蛋白。ruvA和ruvB基因得产物促进异源双链得形成。RuvA蛋白可以识别Holliday连接体得结构,RuvB就是一个腺苷三磷酸酶并可能提供支链迁移得动力。RuvA在交叉点处与DNA所有得4条链相结合,在交叉点得上游,两个RuvB六聚体环状结构分别与每个双螺旋相结合。RuvAB蛋白复合体可以使支链以10～20bp得速度迁移。第三个基因ruvC编码一种能够特异性地识别Holliday连接体得核酸内切酶,此酶可以在体外切断此种交叉而拆分重组中间体。一个含4个碱基得序列提供了RuvC拆分Holliday连接体得热点。这一序列决定了拆分过程中哪一对DNA链被切断,从而决定发生得就是补丁型重组(patchrebination)还就是剪接型重组(splicerebination)。第四节位点特异性重组位点特异性重组发生在特殊序列对之间,这一重组型式最早就是在λ噬菌体得遗传学研究中发现得。λ噬菌体有两种存在型式:裂解状态和溶源状态。两种类型间得转换就是通过位点特异性重组实现得。一、λ噬菌体DNA得整合与切除为了进入溶源状态,游离得DNA必须整合(intergrate)到细菌DNA中去;而为了从溶源状态向裂解状态转化,原噬菌体DNA则必须从细菌染色体DNA上切除(excise)。整合和切除均通过细菌DNA和λDNA上特定位点—附着点(attachmentsite,att)之间得重组而实现。细菌染色体上得附着点(attλ)称为attB,含有B、O、和B’三个序列(BOB’)。突变后可以阻止λDNA得整合。λ噬菌体得附着位点称attP,由P、O和P’三个序列组成。其中O序列就是attB和attP所共有得,序列完全一致,称核心序列(coresequence)、就是位点特异性重组发生得地方。整合反应由λ噬菌体int基因得产物整合酶(integrase,Int)催化。Int就是一种DNA结合蛋白,对POP’序列有强得亲和力。整合反应还需要一种有大肠杆菌编码得一种细菌蛋白,称为整合宿主因子IHF(integrationhostfactor,IHF)。Int和IHF可以在体外进行位点特异性重组。切除反应发生在原噬菌体两端得attL和attR之间,产物为λ噬菌体环状DNA和细菌染色体DNA。催化切除反应得除了Int和IHF外,还需要一种叫做切除酶(exicisionase,Xis)得蛋白参加,该酶由λ噬菌体得cis基因编码。Xis对控制反应方向起重要作用,她就是切除反应所需要得,但却抑制整合反应。整合和切除反应所需要识别得序列对不相同。整合要求对attB和attP之间进行识别,但切除要求对attL和attR识别。因此位点特异性重组得方向性特征由重组位点得特征所控制。整合和切除反应皆需Int和IHF蛋白。λ噬菌体DNA得整合机制

λDNA得整合涉及到attB和attP得核心序列DNA链得割裂和重接。首先在attB和attP位点上产生同样得交错切口,形成了5’-OH和3’-P得末端。5’单链区全长7个碱基。两个核心区得断裂完全相同,连接过程不需要任何新DNA得合成。在整合反应中,互补得单链末端交互杂和,连接并完成整合过程。整个反应中没