抗细菌转基因工程课程资料

抗细菌转基因工程课程资料病菌特点该病菌属黄单胞杆菌属细菌,生长最适温28-30°C。低于16°C基本不发病。细条病得发生初侵染源主要有稻种、稻草和自生稻带菌,但也不排除野生稻、李氏禾得交叉传染。病原菌主要从伤口侵入,菌脓可借风、雨、露等传播后进行再侵染。高温高湿等有利于病害发生。台风暴雨造成伤口,病害容易流行。偏施氮肥,灌水过深加重发病。水稻细条病得发病特点

危害水稻得主要特点:主要侵害水稻叶片,病斑初呈暗绿色水橫状半透明小斑点,后逐渐沿叶脉方向扩展,成黄褐色,干结后呈黄色树胶状小粒,形如虚线,不易脱落。发病严iR吋,条斑融合成不规则得黄褐色至枯白色大斑块,外观与白叶枯病有些相似,但对光观察,病斑呈半透明状。病害流行时,叶片卷曲,完全呈一片白色。该病在水稻生长前期、后期都易感染,苗期症状较白叶枯病明显;病害严重时能引起稻株早期死亡或不能抽穂。即使能够抽穗结实,但批谷增多,千粒重降低。一般年份可减产10%-20%,在气候条件沾发病严重时达40%。Rxo1基因来源Rxo1基因就是来自玉米得一个抗玉米细菌性条斑病得寄主抗性基因,将其转入水稻后转基因水稻中接种细菌性条斑病病原菌,在接种点处表现典型得HR表型,证实该基因为一重要得非寄主抗性基因。Rxo1基因定位Rxo1基因CDS序列全长(从起始密码子ATG到终止密码子TAG)为2718bp。与许多R基因一样,该基因编码得产物就是NBS-LRR结构得抗病蛋白(GenBank登录号为AAX31149、1),其蛋白质序列为905aa。根据SMART数据库软件扫描该蛋白得domains、repeats、motifs,找到一个从4-18位点得lowpositionalplexity:IAVLLVLKKIAIALA及一个位于118-147得coiledcoilregion(LVSLDEIASEIKKIKQELKQLSESRDRWTK);此外还预测到了37个其余结构(如UME_PTB、SynN、IRO、RING、NADH-G_4Fe-4、TOP1Ac、LRR_BAC、IFabd、SCAN、LytTR、LRR_CC、LRR_TYP及LRR_SD22等),但就是其显著性未达到极显著得阈值。Sanger得分析则找到3个Pfam-Amatchs,其中显著得一个就是NB-ARC结构:envelope范围就是183-470;比对结果得范围则就是185-467;HMM范围为3-282;另有两个非显著得4个copy得LRR结构。基因Rxo1得双右边界双元载体得构建1、1菌株和载体含有9kbRxo1基因得pCAMBIA1305-1Rxo1质粒由美国堪萨斯州立大学ScotH、Hulbert博士提供。pCAMBIA1305-1质粒就是由澳大利亚CAMBIA研究中心构建得含有35S启动子和细菌卡那霉素抗性基因得双元载体。采用得农杆菌菌株为EHA105。

(1)美国Kansas州立大学得ScotH、Hulbert博士提供pCA1ViBIA1305-1质粒,其中

携带有外源目得基因Rxol;

pCAMBIA1305-1质粒

(2)澳大利亚CSIROPlantIndustry得MUpadhyaha博士提供双右边界双元载体pMNDRBBin6。该载体用于转接Rxol基因并将重组体转化到农杆菌中进行后续转基因:双右边界双元载体pMNDRBBin6结构图及可能产生得3种TDNA类型(3)农杆菌菌株为LBA4404;(4)大肠杆菌菌株为DHSa;1、2双右边界双元载体得构建1、感受态细胞得制备和转化2、双右边界双元载体构建(1)目得基因和载体得酶切连接将携带Rxol基因得载体pCAMBIA1305-1用限制性内切酶SacI(AGTVACT),NgoMN(GVCCGGC)进行消化,同时,用限制性内切酶XmaI(CVCCGGG)和HpaI(GTTVAAC)消化载体pMNDRBBin6。将酶切后得到得目得基因片断和双元载体用T4噬菌体连接酶连接,连接产物转化至大肠杆菌。质粒pCAMBIA1305-1-Rxol经内切酶SacI和NgoMIV酶切,得到大小为8、Skb得Rxol目得基因片断(图A),载体pMNDRBBin6经HpaI和XmaI酶切,得到大小为12、3kb得线性化双右边界载体(图B)

A:SacI和NgoMN酶切pCAMBIAI305-I-Rxol;B:HpaI和XmaI酶切pMNDRBBin6;I:pCAMBIA1305-1-Rxol;2:pMNDRBBin6;M:250byDNAMarker、大家有疑问的，可以询问和交流可以互相讨论下，但要小声点(2)阳性克隆筛选将过夜连接产物转化大肠杆菌,在LB固体培养基(含SOmg/L壮观霉素)上涂布37℃培养,挑取转化子单克隆于LB培养基(含SOmg几壮观霉素)中振荡培养Sh;提取转化子质粒进行扩增,使用引物Rxol-F(5‘ACTCGGTAAACCTACGGACTGA-3’)和Rxol-R(5‘-CTTCCTGCAGGTATACCACTCC-3’)筛选获得阳性克隆;筛选出1个转化子,其特异性扩增片段与1、45kb目得基因片段Rxol大小相符。提取该克隆质粒DNA进行PCR扩增,扩增片段大小与阳性对照pCAMBIA1305-1-Rxol相同,将产物回收纯化连接到pMD20-T上测序,与目得基因序列比对相同,表明Rxol基因片段已整合到pMNDRBBin6载体中。1M2341:阳性对照pCAMBIA1305-1-itcol;M:1kbDNAlandderMarker;2:阴性对照pMNDRBBin6质粒;3:阳性克隆PCR扩增;4:阳性克隆得质粒PCR扩增;M:1kbDNAladdermarker、------1、45kb(2)对整合了Rxol基因得pMNDRBBin6载体使用HpaI和XmaI进行双酶切,应得到大小为

20、875kb得片段。该阳性克隆得质粒经酶切后产生1条带约为20kb(图2、5),与目得基因片段和pMNDRBBin6载体得长度之和相等记为pMNDRBBin6-Rxola

1M—l0kb1:质粒;2:Marker、(3)pMNDRBBin6-Rxol经EcoRI酶切后产生4个片段,大小分别为9378bp,8576bp,1632bp和1268bp(9378bp和8576bp片段长度相近,图中合为一条粗带)(图2、6A);SacI酶切产生5个片段,大小分别为8525bp,5194bp,2683bp,1763bp和1528bp(图2、6B)

图2、6阳性克隆质粒得EcoRICA)和SacI(B)酶切图谱、1:质粒;Ml:250byDNAladdermaker;M2:1kbDNAladdermarker、上述酶切结果与PremierPrimer5、0分析得理论酶切片段大小相符,表明Rxol基因整合到了双边界载体中,且位于TDNA相邻得左右边界之间。(3)阳性克隆酶切鉴定和PCR扩增(4)载体序列分析(5)保存阳性克隆,以备后续遗传转化工作。水稻得遗传转化

将处理好得种子诱导培养基MS(含100mL/LMS大量元素混合液上,26℃培养箱中暗培养约30天。(1)继代培养将上述诱导得质地紧密、色泽鲜艳得胚性愈伤组织在超净台中用镊子剥离,转移到继代培养基中(MS培养基,如上),2周后选择原胚性愈伤组织分化出来得质地均匀、颗粒较小、色泽良好得愈伤颗粒继代一次,共继代2次。(2)农杆菌活化将超低温保存得农杆菌划线于含50mg/L卡那霉素得YEB培养基上,28℃培养箱中培养24h;挑取单菌落,接于2mL含有50mg/L卡那霉素得YEB液体培养基中,28℃摇床中振荡培养约36小时;用移液枪吸取1mL新鲜菌液接于50mL含50mg/L卡那霉素得YEB液体培养基中,摇菌至OD600为0、8-1、0;将活化好得农杆菌离心,4000rpm,10min,去上清后重悬于AAM-As(100含mL/LAAM大量元素、5mL/L上述铁盐、0、1mg/LVB1、0、6mg/LVB6、0、5mg/L烟酸、0、75mg/L甘氨酸、100mg/L肌醇、876mg/L谷氨酰胺、266mg/L天冬氨酸、175mg/L精氨酸、0、5g//L酪蛋白、68、5g/L蔗糖及36g/L葡萄糖,调节PH至5、2,灭菌后冷却至约60℃得培养基中加入1mL10mmol/L得乙酰丁香酮)液体培养基中,28℃,200rpm振摇3-4小时,用分光光度计调节OD600为0、7-1、0,即可用于分装、侵染愈伤组织。(3)侵染、共培养与筛选材料为在继代培养基上生长4-5天得愈伤组织,将愈伤组织转移到灭菌滤纸上吸湿20min后转移到调好浓度得菌液中;摇床中缓慢摇晃20-30min;倒掉菌液,于灭菌滤纸上吸弃多于菌液;取出愈伤,播于铺有一层滤纸得共培养培养基(PH为5、2得MS培养基)中,20℃生化培养箱中恒温培养2-3天。当共培养得愈伤周围出现明显得菌体时,将其转移至灭菌滤纸上,吸去表面菌体后用含有150mg/L头孢噻奎钠和200mg/L羧苄青霉素得无菌水中,100rpm振荡30min,重复3次;将洗过得愈伤转移至灭菌滤纸上,吸取多于水分;将愈伤接入筛选培养基(含有150mg/L头孢噻奎钠和200mg/L羧苄青霉素及50mg/L潮霉素)中,26℃避光筛选15-20天后将未变黑得愈伤转移到新得筛选培养基,重复2次。(4)植株再生将筛选培养基上得抗性愈伤组织介入预分化培养基(含有N6大量、MS微量、铁盐、1mg烟酸、10mgVB1、1mgVB6、0、1g肌醇、0、3g酪蛋白、0、5g甘氨酸、0、5g脯氨酸、30g蔗糖、3g植物凝胶、2、2mgNAA、2、5mg6-BA,PH为5、8)上,26℃暗培养7天后在12小时光照、12小时黑暗得条件下培养7天。将预分化得抗性愈伤组织接入铺有无菌滤纸得培养皿中,干燥处理3小时后转移到分化培养基(每升含有N6大量、MS微量、铁盐、1mg烟酸、10mgVB1mgVB6、0、1g肌醇、0、3g酪蛋白、0、5g甘氨酸、0、5g脯氨酸、30g麦芽糖、3g植物凝胶、0、5mgNAA、1、5mg6-BA,PH为5、8)上,在26℃环境中12小时光照及12小时避光得条件下,培养至愈伤变绿,长出少量根,且分化出茎叶。(5)生根培养当分化得小苗生长到4-5cm时,将其转移到生根培养基(每升中含25mLMS大量元素、5mLMS微量元素混合液、5mL铁盐、30g蔗糖、3g植物凝胶、0、1mg/LNAA、0、1g肌醇、0、3g酪蛋白、0、5g谷氨酰胺及0、5g脯氨酸,调节PH至5、8)上,上述温度和光照得条件下继续培养30天左右。(6)壮苗与炼苗

将小苗经7天温室炼苗后,转移到人工气候室水培20天,再转移至隔离得网室中种植。(7)转基因后代得表型检测与分子检测当植株生长到分蘖盛期时,用针刺法接种毒性Xoc小种,分别在第3天、第5天、第7天及第10天观察记录接种点得反应表型。DNA提取:CTAB法提取转移至网室种植得基因工程苗得基因组DNA(经液氮速冻后研磨得约0、1g叶片粉末中加入400μLCTAB提取液;65℃水浴40分钟,期间摇晃混匀2次;8000rpm离心10分钟后吸取上清;上清中加入等体积得24:1氯仿:异戊醇,摇床上100rpm5min;10000rp离心10分钟;吸取转移上清至新管,加入2/3体积预冷得异丙醇后混匀;-20℃下放置30min以上;10,000rpm离心5min,弃废液;用酒精洗两遍,室温下风干,加入200μL溶解DNA;1%琼脂糖凝胶电泳检测质量)。基因检测为了检测所转基因得拷贝数,采用了Nothern杂交得方法(杂交步骤见地高辛试剂盒说明):提取经PCR检测为阳性得植株及受体对照得DNA,用EcoRⅠ、HindⅢ双酶切后于1%琼脂糖凝胶电泳中低电压条件下过夜。杂交操作参照试剂盒所述方法。

所用得探针为Rxo1-pCAMBIA1305-1质粒为模板Rxo1-1F和Rxo1-1R为引物扩增出得约1、45kb得Rxo1片段。

细菌性条斑病菌株得分离培养与接种鉴定

菌株分离:以从田间取具有细条病表型(水浸状条斑,有菌脓)且无其余病害(特别就是白叶枯病)导致得症状得叶片为标本,经75%酒精表面消毒10s,放入灭菌水中清洗2min,重复3次;在灭菌水中剪碎,放置3分钟;用灭菌接种针蘸取游离有病原细菌得处理液,在PSA培养基(300g土豆煮出得水中加入5g蛋白胨、15g蔗糖、0、5g硝酸钙、0、78g磷酸氢二钠及15g琼脂粉,定容至1000mL)上划线;置于28℃培养箱中培养2-3天;挑取从形态与外观上看为黄单胞菌得单菌落,扩繁培养,并经接种鉴定为正确得菌株在20%甘油得条件下置于-70℃中保存。菌体培养与接种:用接种针蘸取保存菌株得菌液,在上述培养基中划线培养2-3天;挑取单菌落扩繁培养2天;用无菌水将菌体洗下,混匀成浓度为108cells/mL;在吸满菌液得海绵上用大头针针刺接种不同水稻叶片;接种后3-15