T-SDAA 0085-2024 畜禽大肠杆菌和沙门菌噬菌体环境改良安全性评价规程

本文件按照GB/T1.1—2021《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由山东省畜牧协会提出并归口。本文件起草单位：山东省农业科学院畜牧兽医研究所，中英噬菌体工程联合实验室，瑞普高科（天津）生物技术有限公司、瑞科盟生物工程有限公司。本文件主要起草人：刘玉庆、胡明、张庆、陈义宝、赵效南、李璐璐、吕强华、刘正洁、赵敏、ThomasSicheritz-Ponten、MarthaClokie、刘爱玲、王友、李培勇、刘长太、吴赞锋、任慧英、孙虎芝、李克鑫、崔万超、赵成新、刘晓。本文件为首次发布。畜禽大肠杆菌和沙门菌噬菌体环境改良安全性评价规程本文件规定了畜禽大肠杆菌和沙门菌噬菌体环境改良安全性评价的评价程序、评价内容、综合判定和实验室生物安全。本文件适用于畜禽大肠杆菌和沙门菌噬菌体环境改良安全性评价。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB4789.2食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定GB/T4789.3食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数GB/T6682分析实验室用水国家标准GB/T13091饲料中沙门菌的测定GB19489实验室生物安全通用要求3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。宿主菌hostbacteria致病性大肠杆菌和沙门菌。3.2裂解性噬菌体lyticphage在短时间内能连续完成吸附、侵入、复制、装配和裂解五个阶段而实现增殖的噬菌体，其基因组不整合入宿主菌的基因组。3.3裂解谱phagelysisspectrum裂解性噬菌体在一定浓度范围专一裂解致病性大肠杆菌或沙门菌，而不裂解益生菌或其它菌种。3.4噬菌体环境改良phageenvironmentimprovement裂解性噬菌体可以感染特定环境中特异性致病菌，通过寄生在致病性细菌体内进行复制增殖，抑制细菌，对环境起到改良作用。5评价程序特异性特异性6评价内容6.1特异性按附录A的规定执行。6.2基因组安全特征6.2.1基因组提取按噬菌体基因组（DNA或RNA）提取试剂盒要求提取噬菌体基因组。6.2.2测序与拼接将提取的噬菌体基因组送测序公司进行二代测序，并利用Newblersoftware软件进行拼接。6.2.3基因注释使用RAST、Prokka软件对基因组进行详细注释。6.2.4基因组比对使用CARD、VFDB、Phaster软件比对有无已知的毒素基因、抗药性基因、整合酶基因和其它可能存在潜在危害的基因。6.3裂解谱/裂解率按附录B的规定执行。6.4宿主菌残留6.4.1宿主菌为大肠杆菌时，按照国标GB/T4789.3的规定执行。6.4.2宿主菌株为沙门菌时，按照国标GB/T13091的规定执行。6.5杂菌计数按照GB4789.2规定执行。7综合判定经检测全部满足：为裂解性噬菌体，且无已知的毒素基因、抗药性基因、整合酶基因和其它可能存在潜在危害的基因；特异性宿主菌为大肠杆菌或沙门菌；对致病性大肠杆菌或沙门菌具有较广裂解谱，不裂解益生菌；无宿主菌残留；无杂菌污染。满足上述所有条件判定为畜禽大肠杆菌和沙门菌噬菌体环境改良安全性合格。8实验室生物安全开展细菌与噬菌体安全性检测的实验室管理应符合GB4789.1、GB19489生物安全要求；废弃物处理按照GB19489规定执行；细菌和噬菌体管理按照《动物病原微生物菌(毒)种保藏办理办法》执行。噬菌体特异性双层平板法A.1原理噬菌体侵染敏感宿主菌后在宿主菌菌涂布平板上形成的肉眼可见的透明圈。裂解性噬菌体可以形成透明的噬菌斑，在适当条件下，一个噬菌体粒子形成一个噬菌斑，可用于检出、分离和效价测定。除非另有规定，仅使用分析纯试剂。A.2.1水：符合GB/T6682三级。A.2.2胰蛋白胨A.2.3酵母粉A.2.4琼脂粉A.2.5氯化钠A.2.6三羟甲基氨基甲烷（Tris）A.2.7硫酸镁A.2.8氢氧化钠A.2.9LB液体培养基：称取胰蛋白胨10.0g/L，酵母粉5.0g/L，氯化钠10.0g/L置于烧杯中；加入所需水量的2/3于烧杯中，用玻棒搅拌，使其全部溶化；用1mol/LNaOH溶液调pH至7.2～7.4；将溶液倒入量筒中，加水定容至所需体积。121℃高压灭菌15min备用。A.2.10LB固体培养基：称取胰蛋白胨10.0g/L，酵母粉5.0g/L，氯化钠10.0g/L，琼脂粉12.0g/L置于烧杯中；加入所需水量的2/3于烧杯中，加热并用玻棒搅拌，使其全部溶化；用1mol/LNaOH溶液调pH至7.2～7.4，将溶液倒入量筒中，加水定容至所需体积。121℃高压灭菌15min备用。A.2.11LB半固体培养基：称取胰蛋白胨10.0g/L，酵母粉5.0g/L，氯化钠10.0g/L，琼脂粉6.0g/L置于烧杯中；加入所需水量的2/3于烧杯中，加热并用玻棒搅拌，使其全部溶化；用1mol/LNaOH溶液调pH至7.2～7.4，将溶液倒入量筒中，加水定容至所需体积。121℃高压灭菌15min备用。A.2.12SM缓冲液：称取Tris6.057g/L，NaCl5.8g/L，MgSO4·7H2O2.0g/L置于烧杯中；加入所需水量的2/3于烧杯中，用玻棒搅拌，使其全部溶化；用1mol/LNaOH溶液调pH至7.5，将溶液倒入量筒中，加水定容至所需体积。121℃高压灭菌15min备用。A.3仪器设备A.3.1电子天平：精度0.1mg。A.3.2电热恒温培养箱：精度±0.1℃。A.3.3恒温震荡培养箱：精度±0.1℃。A.3.4滤膜：0.22μm，水系。A.4试验步骤除非另有规定，所有无菌操作均在生物安全柜中进行。A.4.1用LB液体培养基按接种量1%（v/v）培养宿主菌至指数期。A.4.2取噬菌体上清液经0.22μm滤膜过滤，取100μL滤液用SM液进行十倍梯度稀释，共稀释10个梯度。A.4.3分别将每个梯度的噬菌体滤液与指数期宿主菌菌液各100μL混合，加入到5mLLB半固体LB琼脂（0.6％琼脂）中，颠倒混匀，倾注于预先备好的下层固体琼脂（1.2％琼脂，20mLLB，已凝固）平板（9cm直径）上，均匀铺平并完全覆盖底层琼脂表面，每个梯度重复3次。A.4.4将平板置于37°C恒温培养箱中倒置培养5h~6h。A.5结果判定观察双层平板，若有透明噬菌斑，表明噬菌体能够特异性裂解宿主菌；若无，表明噬菌体不能特异性裂解宿主菌。A.6注意事项A.6.1双层平板的下层固体培养基提前倾倒，凝固备用。A.6.2双层平板的上层半固体培养基冷却至55°C左右加入噬菌体和宿主菌，以免影响宿主菌生长。噬菌体裂解谱/裂解率测定点斑法B.1原理噬菌体侵染敏感宿主菌后在宿主菌涂布平板上形成的肉眼可见的透明斑。B.2试剂或材料除非另有规定，仅使用分析纯试剂。B.2.1水：符合GB/T6682三级。B.2.2胰蛋白胨B.2.3酵母粉B.2.4琼脂粉B.2.5氯化钠B.2.6三羟甲基氨基甲烷（Tris）B.2.7硫酸镁B.2.8氢氧化钠B.2.9不同O抗原大肠杆菌，见表B.1。表B.1常见不同O抗原大肠杆菌菌株编号O抗原动物来源采集部位菌株编号O抗原动物来源采集部位E1O1鸡肝脏E28O78鸡肝脏E2O2猪肝脏E29O81鸭心脏E3O3鸡肝脏E30O83鸡胚E4O4鸭肝脏E31O86鸭肝脏E5O5鸡肝脏E32O88鸡肝脏E6O8鸭胚E33O96鸡肝脏E7O9鸭肝脏E34O98猪肝脏E8O11鸡肝脏E35O100鸡肺脏E9O15鸡肝脏E36O102鸡肝脏E10O16鸭肝脏E37O109鸭肝脏E11O17猪肝脏E38O116鸡胚E12O18鸡垫料E39O119鸭肝脏表B.1常见不同O抗原大肠杆菌（续）菌株编号O抗原动物来源采集部位菌株编号O抗原动物来源采集部位E13O22鸡胚E40O121鸭胚E14O23鸭肝脏E41O125鸡肝脏E15O24鸡肝脏E42O130鸡胚E16O25鸡肝脏E43O134鸡胚E17O29鸡肝脏E44O143猪肝脏E18O33鸭胚E45O145鸭肝脏E19O36鸭肝脏E46O153鸡肝脏E20O39猪肝脏E47O156鸭肝脏E21O43鸭肝脏E48O157奶牛肝脏E22O45鸭胚E49O166鸡肝脏E23O53鸡肝脏E50O171猪肝脏E24O54鸭肝脏E51O176鸡肝脏E25O63鸭肝脏E52O182鸡胚E26O66鸡肝脏E53O185鸭肝脏E27O69鸭肝脏B.2.10不同血清型沙门菌，见表B.2。表B.2常见不同血清型沙门菌群1相BS.ParatyphiBbiS.DerbyS.AgonaS.StanleydS.IndianazckS.MbandakaS.NowportrS.BovismorbificansS.KentuckyiS.DublinS.Panama表B.2常见不同血清型沙门菌（续）群1相S.PullorumE1-E2-S.MeleagridisrS.LondonS.AnatumS.SenftenbergG1-G2S.HavanaIS.HvittingfossbKQbS]YS.AustraliaB.2.11益生菌，见表B.3。表B.3常见益生菌种属属种乳杆菌属嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、双歧杆菌属动物双歧杆菌、嗜热双歧杆菌、乳双歧杆菌肠球菌属粪肠球菌、屎肠球菌链球菌属嗜热链球菌、乳酸链球菌芽孢杆菌属枯草芽孢杆菌、地衣芽胞杆菌梭菌属丁酸梭菌B.3仪器设备B.3.1电子天平：精度0.1mg。B.3.2电热恒温培养箱：精度±0.1℃。B.3.3恒温震荡培养箱：精度±0.1℃。B.3.4滤膜：0.22μm，水系。B.4试验步骤B.4.1将所有待测菌株按接种量1%（v/v）培养分别培养至指数期。B.4.2各取100μL菌液，分别加入到5mLLB半固体培养基（0.6％琼脂）中，倾注于预先备好的下层固体琼脂（1.2％琼脂，20mLLB，已凝固）平板（9cm直径）上混合制备双层平板。B.5.3将待测噬菌体液10倍梯度稀释3次，每个梯度取2.5μL点于