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职业教育医学生物技术专业教学资源库实验PCR扩增人谷胱甘肽转移酶基因一、实验原理

利用反应温度的变化，在PCR反应体系共同存在的条件下，经过变性、退火、延伸三个过程的循环，耐热TaqDNA聚合酶催化待扩增DNA合成的反应，以达到对靶序列的体外大量扩增。谷胱甘肽转移酶是细胞抗损伤、抗癌变的主要解毒酶之一，其基因多态性（某位点发生碱基变化）的存在可引起其表达此酶的活性不同，导致解毒功能发生改变，从而增加特定肿瘤发病风险。职业教育医学生物技术专业教学资源库二、实验试剂（一）PCR扩增反应试剂1.模板DNA（10µg/mL）

以EDTA抗凝血为样品，从中提取人类基因组DNA2.引物（10µmol/L）

上游引物序列：5’-GCAGCATGTGGCACCATCTC-3’

下游引物序列：5’-AGAGCCATGGACCCCCACAC-3’

预测扩增产物长度：420bp3.TaqDNA聚合酶（2.5U/µL）4.dNTPs（2.5mmol/L）5.10×PCRbuffer6.双蒸水职业教育医学生物技术专业教学资源库二、实验试剂（二）PCR产物检测试剂1.琼脂糖（电泳级）：琼脂糖凝胶的孔径可以通过琼脂糖的浓度来控制，浓度越高孔径越小。职业教育医学生物技术专业教学资源库二、实验试剂2.电泳缓冲液：维持电泳环境中溶液pH的稳定性，抑制核酸酶的活性，防止DNA的降解，有利于核酸分子的迁移。职业教育医学生物技术专业教学资源库二、实验试剂3.核酸荧光染料：EB（溴化乙锭：强致癌剂，操作时戴手套）或GelGreen，能特异结合核酸在紫外灯下发出荧光。4.上样缓冲液（6×LoadingBuffer）：甘油可增加样品密度，使其比重增加，确保样品均匀沉入胶孔内；溴酚蓝可以使样品呈色，加样操作更为方便，在电泳中呈现指示带，可预测样品电泳的速度和位置。5.DNAmarker（核酸分子量参照物）：根据扩增条带的大小来选择合适的DNAmarker。职业教育医学生物技术专业教学资源库三、操作步骤（一）采血（二）提取人类白细胞基因组DNA（模板）（三）配制反应体系，在PCR反应管中配制反应体系，混匀并将离心至管底。（四）确定反应条件，在PCR仪上设置反应条件（五）扩增反应，将PCR反应管放入PCR仪中，启动反应条件职业教育医学生物技术专业教学资源库职业教育医学生物技术专业教学资源库职业教育医学生物技术专业教学资源库三、操作步骤（六）电泳分析结果1.准备电泳缓冲液2.制胶：1.2%琼脂糖，EB终浓度为0.5µg/mL，样品孔置于负极端3.加样：Marker和PCR扩增产物分别加到上样孔内4.电泳：100V，30min5

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