分子生物学 第6章学习资料

第6章基因表达调控

(ControllingoftheGeneExpression)阐明的科学问题真核与原核生物如何调控数以千、万计的基因以最为经济、有效的时空模式进行转录，从而实现对环境的适应、细胞的分化,组织的特化和个体的发育。原核生物与真核生物基因表达调控机制具有惊人的相似性共同的起源与共同的分子基础调控机理上调控层次上核酸分子间的互作核酸与蛋白质分子间的互作蛋白质分子间的互作transcriptionallevelpost—transcriptionalleveltranslationallevelpost—translationallevel基因表达的调控涉及RNA转录的开/关数量选择性加工蛋白质翻译速率数量加工、降解和分泌…转录水平上的调控是最为经济,

灵活，又是最为重要，复杂的调控●在复杂的基因组内，确定需要基因转录的起始位点●精细调节基因表达的水平,以保证生物体对环境的适应●

cisfactor&transfactor间严格而又灵活的互作●保证RNApolymerase的进行式转录

（不中断，准确终止）遗传信息的概念C>c10%;结构基因的编码序列

tripletcodon（I类遗传信息）90%;重复，间隔，调节序列…

基因选择性表达指令重要的遗传信息（II类遗传信息）全基因组遗传信息的两大类别II类；特定DNAseq.+特定蛋白质/核酸结合基因表达的指令geneon/offI类；DNAseq.RNAseq.(codon)aaseq.proteinphenotype(centraldogma)遗传信息表达的方式组成型表达（constitutiveexpression）管家基因(Housekeepinggene):维持细胞基本代谢过程所必需的、

在不同的细胞类型和细胞生长时期组成型表达的基因。诱导型表达（inducibleexpressionbysignalingmolecular）奢侈基因(Luxurygene):细胞分化、生物发育以及生物适应环境所需要的基因。

这类基因的表达具有明显的时空调控特性。6.2.原核生物基因表达调控的理论与模式6.2.1.transcriptionallevelcontrol

Prok.

operonstringentresponseattenuator6.2.1.1.Operoncontrol

(1961Jacob.&Monod.)a)operonconcept●控制某一代谢途径的相关基因,

紧密连锁地排列在一起,协调表达,受同一操纵子控制●各结构基因按一定比例协调翻译(Z:Y:A=5:2:1)Z:半乳糖苷酶Y:半乳糖苷透性酶A:半乳糖苷乙酰基转移酶●具有极性突变效应●P（启动子,cis

）&O基因(操纵基因，cis)紧密连锁或

彼此重叠;I基因(调控基因，trans)位点不固定LacoperonIpoZYAb)operoncontroltype

Negative(负调控)

&Positive(正调控)

IgeneNeg.Pos.i-or不加入I基因产物operononI+

or加入I基因产物operonoff

i-or不加入I基因产物operonoffI+or加入I基因产物operononrepressor(阻遏物)

NegativePositiveexpressor(apoinducer)无辅基诱导物激活物●RepressorbindingonOsite阻止转录启动●

Operonoff●

Negativecontrol

是广泛保险的机制（自然选择使Prok.获得选择优势）Positivecontrol

是灵活，严格，经济的调控机制

Expressorbindingfrontpsite意味转录效率极低激活转录启动c)Model●

SignalmolecularbeneededforbothtypesAddsignalmol.

OperononAddsignalmol.

Operon

offCo-repressor(辅阻遏物)Inducer(诱导物)(inducibleoperon)(repressibleoperon)根据操纵元对于能调节它们表达的小分子(效应物)的反应性质,将操纵元分为可诱导的操纵元(Inducibleoperon)和可阻遏的操纵元(repressibleoperon).negativepositiveInd.Rep.activeactiveinactiveinactive活性阻遏物诱导物无活性阻遏物无辅基诱导物诱导物活性诱导物无活性阻遏物辅阻遏物活性阻遏物Operoncontrolmodel活性无辅基诱导物辅阻遏物无活性诱导物

Negative—inducibleoperon

例(分解酶类lactoseoperon)

Igene

activerepressorIbindingonOperator38kd/monomertetramer152kd

iS(super--reperessible)突变发生在阻遏蛋白与效应物的结合位点I+

mut.iC(constitutivemut.)阻遏蛋白的DNA结合位点发生突变，不能与O基因结合Ogene(operator)cis-actionfactormRNAstartpointunwinding

RNApolymerasebindingRepressorbindingObstruction?Competition?Ogene(operator)cis-actionfactorSymmetricalseq.

of

21bp&G/CasaxisTcanbecrosslinkedtorepressor(bindingsite)MethylationenhancedbyrepressorProtectedbyrepressoragainstmethylationOgene(operator)cis-actionfactorO+—mut.

OCoccurfrequentlyatleftsiteofaxis调控机理Inducer(lactose)

与repressor特异结合tetramer变构

特异结合力下降1000X作用于O

位点上的repressor

变构

脱离O位作用于游离的repressor

operononrepressortetramer与operator发生特异结合

operonoff

变构

失去结合于O位的能力w.t.(I+O+P+)诱导型addinducer

operononnoinducer

operonoffOC失去与repressor特异结合的能力OC

mut.(I+

OC

P+)constitutivemut.（组成型）iC

mut.

(iC

O+P+)constitutivemut.(组成型)iCgene产物repressor丧失与O位点结合的能力iS

mut.(iS

O+P+)super-repressionmut.(超阻型)iSgene产物repessor

不能与inducer结合等位基因间的显隐关系

ic

poZYA

ic

I+

ic

tetramerNonbindingrepressortetramertetramertetramerLactose变构iCgene产物repressor丧失与O位点结合的能力

I+

>

iC等位基因间的显隐关系I+/ICiSpomutrepressorI+tetramerlactose等位基因间的显隐关系iSgene产物repessor

不能与inducer结合

iS

>

I+IS/I+iS

>

iCOC失去与repressor

特异结合的能力

cis-dominantOC

＞O+I+OC

ZYAlactose等位基因间的显隐关系I+O+mRNAmRNA

cis-dominantTheabilityofasite(cis-factor)tocontroladjacentgeneirrespectiveofthepresenceinthecellofotherallelesofthesite.cisactingfactor

对与其紧密连锁基因的控制效应不受其等位基因的影响1961Jacob.&Monod分离了大量的突变体,将这些突变基因分别与大肠杆菌的性因子即F因子相连成F’因子,再将其导入大肠杆菌,产生部分二倍体进行互补试验.LacI+O+Z+/F’LacI+Oc

Z+基因型Lac基因的表达LacIc

Oc

Z+/F’LacI+O+Z+LacI+O+Z-/F’LacIc

O+Z+LacIc

O+Z+/F’LacI+Oc

Z-LacIsO+Z+/F’LacI+Oc

Z+LacIc

O+Z+Y+/F’LacI+Oc

Z-Y+组成型组成型诱导型诱导型组成型Y:组成型Z:诱导型LacIsO+Z+/F’LacI+O+Z+不表达InactiveexpressoractiveexpressorPositive—inducibleoperon(多为分解酶类)I

inactiveexpressoroperonoffinduceractiveexpressorbindingonfrontPsite激活RNApolymerase启动无活性激活物operononPositive—inducibleoperon(多为分解酶类)w.t.(I+O+P+)诱导型iS

mut.

超阻突变(super-repression)expressorcannotbeactivatedbyinduceroperonoffI+

>

iS负调控诱导型中iS>

I+

（iS突变后不能和效应物结合，但是可以结合O基因,而且结合O基因后不能被效应物结合而去抑制）e.g.cAMPcontrol

(universalcontrollingsystem)LacoperonoffnotranscriptsGlucoseLactoseE.coliWhy?J.Monoddiauxy半乳糖苷酶乳糖半乳糖苷酶β异构乳糖（乳糖操纵子的效应物、诱导物）加入乳糖初期或葡萄糖刚耗竭时，β半乳糖苷酶还没有合成，细菌如何获得异构乳糖？基因表达的关闭，往往不是完全的彻底的关闭，存在调控的渗漏（leaky）现象。在极低水平上表达，将痕量的乳糖转变成异构乳糖。ATPpppcAcAMPpcA

5’-AMPpcAC(capgene)(cAMP

acceptorprotein)(orcatabilitegeneactivatorprotein)cAMPase(-)phosphodiesterase(+)+GlucoseLac.Operon

IPO葡糖糖通过调节CAP-cAMP的量控制多种糖代谢的操纵子（如半乳糖操纵子，阿拉伯糖操纵子）Stimulationofβ-galactosidasesynthesisbycAMPwithwild-typeandmutantCAPPastan1970P.N.A.S.

480-487,June66(2)CAP-cAMPcomplexisimportantforlac

operontranscriptionCAP对所有葡萄糖敏感操纵子都是正调控因子,若CAP发生突变，因失去正调控作用而使细胞不能利用多种糖源.

cAMP—CAP

具有广泛生理效应的正控制系统存在于多种基因表达调控体系中LacoperonexpressioncAMP(Positive-inducible)lactose(Negative-inducible)虽然从调控机制上可以将操纵子分为正/负系统、诱导/阻遏类型，但启动一个操纵子的表达往往同时受到多种类型的调控。Negative—repressibleoperon(合成酶类)e.g.1tryptophansynthease

operonIgene

inactiverepressor(无活性阻遏物)Co-repressor(辅阻遏物):tryptophan(色氨酸)trpRPOEDCBAtrpRPOEDCBAtryptophan调控机理Operatoroperonoffoperononrepressor+trpactiverepressorRepressor(inactive)cannotbindontheOsite(trpabsent)生物经济利用资源的调控机制w.t.(I+O+P+)阻遏型iC

mut.(iCO+P+constitutivemut.)OCmut.(I+OCP+constitutivemut.)OC

>O+(cis-dominant)

iCinactiverepressorcannotbeactivatedbyco-repressorOCcannotbeboundbyactivatedrepressorI+

>

iCe.g.2Arg

synthetase

operonRegulon:调节子,

受一个共同的调节基因调控的若干个操纵子所组成的表达调节系统.poApoGRpoD

poBCEHpoF

repressor

ArgactiveexpressorCo-repressorPositive—repressiblecontrolI

activeexpressor(apoinducer)

operononCo-repressorInactiveexpressoroperonoffw.t.(I+O+P+)阻遏型iS

mut.

inactiveexpressor

不能激活RNApol.转录不能启动I+

>

iSd)基因表达调控的综合实例HistidineUtilizationoperon(Hut)HistidineUtilizationoperon(hut)a)Histidine(组氨酸)代谢过程Histidine尿刊酸咪唑丙酮酸HistitaseUrocanaseIPAhydrolase亚氨谷氨酸FGAhydrolaseGlutamateGlub)operontype&structureNegative—inducibleoperon(regulon)byCgene(repressor)HistidineasinducerPIG

Repressor

CPOOUHPIGPOOUH

CNoHistidine

HistidinepresentHistidinepresentPIG

Repressor

CPOOUHPIGPOOUH

CCAP-cAMPPositive—inducibleoperon

byCAP—cAMP

GSpositive—induciblecontrolmodelHistidinepresentPIG

Repressor

CPOOUHPIGPOOUH

C活化的谷氨酰胺合成酶GS(或NR-pi)Positive—inducibleoperon

byGS(Glutaminesynthetase

谷氨酰胺合成酶

)NR-pi(phosphorylatedNitrogenreductase)

NH3

+α-ketoglutarateGlu+NH3+ATPGln+ADP+PiGSGOGATNO3－NH3NR,NiRNO3－NH3NR1+AMP(inactive)NR1-Pi(active)Phosphorylated

NitrateReductasePII(ATPase’sregulatoryprotein)PII-(UMP)4Uridilate-PIIStimulatedbyα-ketoglutarateStimulatedbyGlutamine(Gln)UTase4UMPH2O(UTP)4(ppi)4UTaseNR1

(inactive)ATPADPNR1-Pi(active)GStranscriptionBindstoupstreamsiteofoperonWhenNstarvedNR1-Pi(GS)

Hut0peron

α-ketoglutarate

Positivecontrol

NH3

+α-ketoglutarateGlu+NH3+ATPGln+ADP+PiGSGlnGOGATNO3－NH3NR,NiRidlingreactionoperontype&structureNegative—inducibleoperon(regulon)byCgene(repressor)

Positive—inducibleoperon

byGS(Glutamine

synthetase)CAP—cAMP一个操纵子的启动表达往往同时受到多种类型的调控6.2.1.2.stringentresponsecontrola)基本概念原核生物在氨基酸饥饿状态下，自动停止或降低(10-20倍)rRNA,tRNA转录，蛋白质、核苷酸、碳水化合物和脂类的合成均明显减少,细胞代谢水平下降,生长速度变慢的现象称为严谨反应.

stringentresponse

是对任何氨基酸饥饿时表现的一种广泛的应急反应调节机制

stringentresponsecontrolb)相关因子

stringentfactor(Relgene）

pyrophosphatetransferasepppGpp（MagicspotII）PPP-CH2GMS2PP

ppGpp（MagicspotI）PP-CH2MS1PPGc)rel-(mut.)的遗传效应w.t.

(Rel+)

yesyes

noyesnoyesyes

nomut.

(rel‑)

yesno

noyesno

no

no

yes?genotypeaa

stringentF.MSI/IIrRNA/tRNApppG+ATPstringentfactor大量pppGppppG+ATPppGppstringentfactor少量EF-TuEF-GRelgened)stringentresponse分子机理Rel

+stringentfactorunchargedtRNAinAsitePPGATPAMPppGpppppGppNulltRNA,肽链不延伸，ATP不断消耗signalmolecular10

upIdlingreaction作为阻遏物关闭rDNA

超纵子,同时阻止tRNA

转录延伸.●抑制rRNA,tRNA转录●放慢转录延伸过程●放慢蛋白质合成过程●启动氨基酸合成基因Idlingreaction紧缩开支，度过难关signalmolecularppGpp+RNApol

RNApol.不易变构ppGpp+转录I位点

阻止RNApol

结合当生存条件恢复正常,spoT基因编码的酶快速降解ppGpp,开放rRNA,tRNA

的转录,保证核糖体重新构建和蛋白质合成6.2.1.3.Attenuator(衰减子)control

a)discovery●

E.coli

trp

synthetase

operon(Negative-repressibleoperon)IPOleadingseq.EDCBAtrp+(往往存在于一些编码氨基酸合成酶类的操纵子中)●1968.ImamatoLab.Whentrplevelislow，RNApolmovesbutfallsoffintheL.S.andthetranscriptionofthestructuregenesisblocked.IPOleadingseq.EDCBALowtrp+thecomplexcannotbindwiththeOsite●1975ImamatoLab.E.coli

trp-AARS(t.s)w.t.

30℃

trpEt.s.mut.

42℃

trpE在Lowtrp

条件下，确保operonopentrp-tRNAtrpProteinsynthesisTrptRNAtrp30℃42℃Nothing(AARS失活)t.s.(42℃)t.s.(30℃)w.t.(30℃)

w.t.(42℃)trpE(E酶活性)Why?AARS野生型trp-AARS在30℃和42℃下都具有活性

t.s.(42℃)AARSinactive

notrp-tRNAtrp

synthesisRNApolmovepastL.S

transcriptoftrp

synthetaseRNA

(Eenzymelevelishigh）

t.s.(30℃),w.t.(30℃),(42℃)AARSactivesynthesizetrp-tRNAtrpRNApolbreakoffatL.S.notranscriptionoftrp

synthetaseRNA

（Eenzymelevelislow）Conclusion:Whentrp

and/ortrp-tRNAtrp

existincells,thereisnosynthesisoftrp

(Fine-tunedcontrol)t.s.(42℃)noAARSandtrp-tRNAtrp,buttakefornotrpbyerror,

（initiatethetranscriptionoftrp

synthetaseRNA)

trp-tRNAtrp

isthemainfactorleadingtoRNApol.fallingoffatL.S.●Fine-tunedregulationwithintheleadingsequence

I+;

operonofflowBactivity

iC;

operononhighBactivity(~70X)ThedifferenceofB

activityofΔED&ΔL.S.ED(~10X)resultsfromtheL.S.Ipo

L.S.EDCBA

genotypeI+

iCTrp

ΔED0.1711.8TrpΔL.S.ED1.32100Whentrpisrich,BactivitydetectedControlstheoperonovera700-fold,rangefromfullyinactivetofullyactive

0.17100?

leadingseqwithcis-actingdomainPartialdiploidtest（trprich）

GenotypeEactivity

AactivityL.S.withoutcomplementaryeffect.L.S.isacis

withattenuationeffect.Cis-dominantFtrpiC

L.S.EDCBA1.414.8trp

iCΔA

L.S.EDCB1.10trp

iCΔE

L.S.DCBA016.5trp

iCΔL-C

BA094trp

iCΔL-C

BA2.5102p-trp

iCΔApL.S.EDCBb)Theprimarystructureoftrp

operonRNA

60~68—75~83&110~121—126~134(palindromicseq.)withpoly(U)

27—68base

ORFof14aa

140baseRNAalmostbindingwithprotein(translatableseq.)

trphighfrequencywith1/7in14aaPeptidesofL.S.forafewOperonsencodingenzymesforaminoacidsynthesiswheretranscriptionattenuationoccurs.(7/16)(7/16)(8/15)Whatdoesthatmean?Theexpressionoftrp

operonunderthea.astarvationE.coli

trpiC

u‑

culturesinthemediumwith9differenta.a.starved,Respectively.AddH3-U，detecttrp

operonmRNA

Trp

codonandorderplayanimportantroleontheexpressionoftheoperonbutArgisimportantlikewise!Why?H3-UmRNAMetIleLeu

Gly

Trp

Arg

ThrHisProc)Thesecondarystructureofthe140NtRNA

E.coli

DNAHpaII含L.S.570dNtDNAfrag.140NtRNADenaturalization/Non-denaturalizationPAGE

&NorthernblottingInvitrotranscription(PP)GN

RnaseT1切割单链的ＧEliminationofthe2ndstructureA

C

B

1407169

43

322518AC

B

noUreawithUreaRecycleA,B,CbandsUreagelABCConclusion:Aband（140Nt）70thNtisG,locatesinthesinglestrandBband（108-140Nt）noGexposesinthesinglestrandCband（52-94Nt）52th--70th--94thisafragmentofAband’sG52G94140AG70G108BG52G94G70C

d)Theanalysisoftheregulatorymechanism1-2/3-42-3Alternativepairingschemeof3formsforthreesequenceinthetrpmRNAleader.Trp(Arg)starvedNon-starved

trp

trp

55--58--65--68--Arg60--70--UGA69--79--2-33-4核糖体翻译到Trp(Arg)时,停工待料,核糖体覆盖区段1,区段2,3形成发夹结构,不能形成终止子结构,RNA聚合酶继续对结构基因进行转录核糖体覆盖区段1和区段2,区段3和区段4形成发夹结构,加上后随的多聚U,形成Rho-independentTRibosomepassthrough

Trp

codon14aaPARibosomepausingatTrp

codon9aaPAThemechanismofAttenuationcontrolYanofskyCharles.1981.Nature.289;751-758ControlthetranscriptionoftheoperonfinelyviathetranslationoftheshortpeptidecodedintheL.S.e)ThebiologicalsignificanceofAttenuationcontrolWhentrplevelislowrepressorisnotenoughtocloseoperonIfanly

trp-tRNAtrpexistincells,AttenuatorwillinterrupttheRNApol.transcriptionintheL.S.

WhentrplevelishighlittleRNApol.PassthroughtheOsiteThefine-tunedregulationintheProkaryotesEnhancetheadaptabilityofprokaryotestotheenvironmentbiologicalsignificance衰减子精细调控的生物学意义:活性阻遏蛋白和非活性阻遏蛋白的转换较慢,而tRNA荷载与否更为灵敏.氨基酸的主要功能是合成蛋白质,因而以tRNA荷载情况为标准进行控制更为灵敏,更精细.为什么大多数这样的操纵元又同时需要阻遏蛋白来调控呢?因为衰减子系统需要先转录出前导肽mRNA,然后根据前导肽的翻译情况来决定mRNA是否继续转录.当氨基酸供应充足时,就没有必要通过这样的步骤,而直接通过阻遏蛋白关闭转录活性.

也就是说,生物体需要一个决定基础水平的控制系统,:当细胞内氨基酸高于某一水平时,可以实现完全的阻遏;而只有低于这一水平时,才需要用衰减子这个微调节旋钮来进行调节.两种机制都是为了避免浪费,提高效率.6.2.2.post-transcriptionallevelcontrol6.2.2.1pre-RNAprocessing(加帽,加尾,剪接,修饰,编辑)(forEukaryotsonly)6.2.2.2AntisenseRNA(反义RNA)andRNAinterference(RNAiRNA干涉)

广泛存在于原核生物（E.coli）和真核生物（plant-mammalian）OmpFompC6.2.2.2.anti-senseRNAcontrolproteintranslation

低渗透压高渗透压

OmpC外膜蛋白

OmpF高渗透压RNApolOmpCmRNAmicFRNA6S174baseOmpFmRNA1983.Miruno&Simons

(mRNA-interferingcomplementaryRNA)

micF-RNAOmpF-mRNAS.D.SeqInitiationcodonmicRNA(anti-senseRNA)binding5”-endofmRNA(S.D.seq.&AUG.)反义基因在耐储藏番茄育种中的应用

ACCgene

(1-氨基丙环烷羧酸氧化酶，乙烯合成途径酶类)

anti-senseACC-mRNA

ACC-mRNA

乙烯合成被抑制

(-)53

mRNA(-)53(+)35

cDNAanti-senseACCgene

pCaMV35s-pCaMV35s-遗传特点

anti-sensegeneofCHS(Chalconesynthesisgene)

stableinheritance(可稳定遗传)

noncompletedominance(杂种F1不完全显性)D.S.RNAunstableandrapidlydegradated

whiteflower

redflower

×redflowerdominance/recessive?

"fortheirdiscoveryofRNAinterference-genesilencingbydouble-strandedRNA".NP2006

6.2.2.2.1RNAinterference(RNAi)的发现与证实AndrewZ.Fire斯坦福大学医学院CraigC.Mello马萨诸塞州立医学院RNAinterference(RNAi)的发现与证实

1990年，RichJorgensen等人发现

苯基苯乙烯酮合成酶基因

矮牵牛花

颜色班驳全白色素的合成不是被增强了，而是被关闭了RNAinterference(RNAi)的发现与证实

1994年，Macino和Cogoni发现

合成类胡萝卜素所需的基因粗糙红色面包链孢霉

30%转化细胞的霉菌本身的基因失活重要的意外发现（SuGuo1995康乃尔大学）抑制秀丽新小杆线虫胚胎对称性基因（par-1）Par-1基因表达特异性阻断Par-1基因表达未被增强反而发生了特异性阻断？！mRNA(ck)anti-mRNA

秀丽新小杆线虫injectionAndrewFire(1998.2华盛顿卡耐基研究院)mRNA制备中污染微量D.SRNA特异性地降解mRNAofpar-1

injectionC.elegans

Interruptionexpressionofpar-1证明；Dr.SuGuo

mRNAofPar-1纯化的A.SmRNAofmex-3

c.elegans

极微弱抑制纯化的D.SmRNAofmex-3

c.elegans

特高效抑制

NamedRNAinterference(RNA干涉)

Double-strandedRNA-inducedRNAInterferencecausesdestructionofaspecificmRNA

Fire,Andrew.etal.Potentandspecificgeneticinterferencebydouble-strandedRNAinCaenorhabditis

elegans.Nature391(1998)f.3,p,809injecteddsRNAofC.elegansmex-3mRNAintoC.elegansovariesafter24h,fixedovariesandhybridizationwithprobe(mex-3mRNA)Noprobe-ckNoinjection+ckInjectionantisenseRNASomemRNAInjectiondsRNA

NodetectedmRNA

RichardCarthew(1998.12匹斯堡大学)Clemens(2000.6密歇根大学)

Drosophila

Zernicka-Goetz(2000.2剑桥大学)Rat(mammalian)

Tehurikov

(2000.8)

E.coli

真菌、拟南芥、锥虫、水螅、斑马鱼……注射、浸泡、喂养

C.elegans电穿孔、基因枪plantcellRNAinterference

RNAi

定义外源或内源性的双链RNA(dsRNA)进入细胞后引起与其同源的mRNA特异性降解，抑制相应基因表达，表现出特定基因缺失表型的现象。RNA干扰抑制基因表达的基本原理

双链RNA(dsRNA)通过细胞膜进入细胞内,在Dicer(RNA酶Ⅲ家族中的一种序列特异性的核酸内切酶)的作用下,被分解为21～22bp,3’端带有2～3nt末端突出的双链RNA分子,这种小的双链的RNA分子被称为小干扰RNA(smallinterferenceRNA,siRNA)。RNA干扰抑制基因表达的基本原理

siRNA

与相关的酶结合,形成RNA介导的沉默复合物(RISCRNA-inducedsilencingcomplex),RISC在ATP供能的情况下,将其携带的双链siRNA

变成单链siRNA

分子,进而成为有活性的RISC。又称为Slicer

Slicer与目标靶mRNA分子结合,会导致目标RNA分子的断裂,进而被核酸酶降解,导致目的基因的沉默。DsRNADicer小干扰RNA,siRNA酶RISCATPDsRNASsRNA活性RISC（Slicer）靶RNA断裂ZamoreCell101:32,2000.

RNA干涉一旦启动，就可将对应的成熟mRNA

全部降解，达到缺失突变的效应

sD.SRNA也可降解pre-RNA,但机率较低。

25ntsD.SRNA极易穿过细胞，进行远距离的转移。穿过核膜，与同源DNA结合，使基因在转录水平上发生沉默由于pre-RNA存在时间短，同时有加工蛋白的结合，阻止干涉复合体的结合。

RNAi是转录后水平的基因沉默的机制

注射D.SExonmRNA被干涉注射D.SIntronorpromoterseq.mRNA不被干涉

d.S

RNAi

具有极高的干涉特异性

仅降解与其相应的mRNA成为21-26小mRNA片断

d.S

RNAi

具有极高的干涉效率

极少的D.SRNAi

可达到较对照高达2个数量级表型可达到缺失突变体效应

d.S

RNAi

的效应可穿过细胞传递存在维持RNAi的特异信号小分子干涉的特征RNA6.2.3.Translationallevelcontrol6.2.3.1.Operon内各基因以一定比例的协调翻译Lac.OperonZ:Y:A=5:2:16.2.3.2.Modulate—codonusage&tRNA“减速挡”对蛋白质翻译速率的调控codonusage低,tRNA少，停工待料，翻译速率慢例:大肠杆菌dnaG,ropD,rpsU,同一操纵子中的三个基因,三个基因在细胞中的基因产物分别为50,2800和40000个拷贝.编码异亮氨酸的三个密码子AUUAUC和AUA(稀有密码子)中,其它蛋白质中AUA出现的概率为1%,而dnaG

中AUA出现的概率为32%.

这类调谐密码子的位点及密度是生物长期进化过程中形成的一种在翻译水平上的调控机制.广泛存在于原核生物和真核生物中.6.2.3.3.InformasomemRNA+自身翻译产物informasome(mRNA储存于卵细胞中，受精后迅速翻译蛋白)绵羊受精卵第四次卵裂前,核基因不表达，利用卵细胞质中储存的mRNA完成细胞分裂储存信息6.2.3.4.蛋白质合成的自体调控

蛋白质与自身mRNA结合核糖体蛋白质合成的自体调控

E.coli

组成核糖体的蛋白50种以上一个核糖体内,除L7/L12具有4个分子外,

其他蛋白均仅为1个分子一个细胞内EF-Tu因子的分子数是核糖体数的10倍

RNApol.各亚基数较核糖体数少核糖体蛋白的合成与rRNA合成严格协调多见于rRNA不足时，核糖体蛋白与自身mRNA结合（其mRNA二级结构与rRNA极为相似）协调机制不同的核糖体蛋白基因组装在一起,并分布在不同的operon中每个operon内都有一核糖体蛋白作为自身operon的调节蛋白在operon的mRNA上具有与调节蛋白结合的位点（靠近或包含S.D.Seq

）该位点与核糖体蛋白在rRNA上的结合位点高度同源，并具有相似的二级结构

调节蛋白与rRNA的结合力高于与自身mRNA的结合力operongene®ulatorstrS12,S7,EF-G,EF-TuspcL14,L24,L5,S14,S8,l6,L18,S5,L15,L30s10S10,L3,L2,L4,L23,S19,L22,S3,S17,L16,L29αS13,S11,S4,α,l17L11

L11,L1

核糖体蛋白质合成的自体调控

operon

中有些基因受该系统的调节有些基因具有各异的调控蛋白质结合位点，受另外体系控制23srDNAGAGGAL11L1L11operonGAGGAmRNA当rRNA充足时当rRNA不足时,多余的L1…regulatorGAGGA关闭核糖体蛋白合成（翻译水平上）L11andL1proteinsynthesisisblockeduntiltheexcessL1disappearsTranslationalrepressionoftheLll

operon.GAGGAGAGGA+5’3’

6.2.3.6.mRNA二级结构对翻译的调节

RNAvirusR17

A-p:C-p=1:180

ARep

C

AUGofA-p

genehideinD.S.region

geneexposedonS.S.region

AUGofC-p

通过对翻译起点的控制，调节蛋白质的合成量及比例

5’(-RNA)

5’

3’

5’

A

C-pbetranslatedfirstly

Rep-pbetranslatedandbindingon

itselfAUG.(replicationenzyme)

C-ptranslationcontinually

Rep-pbindingon3’of+RNAsynthesis–RNAchainofR17

(180)

(1)A-pbetranslatedby+RNA

Butastemplateonlyforveryshort

time.

RNAform

A“flower”ofsecondstructure

AndAUGofA-pgeneclossed

3’(-)5’

5’(+)

3’(-)5’

A

5’(+)6.3.2.7.Trans-Factor

可逆性磷酸化对转录与翻译的调节InitiationoftranslationinEuk.eIF-2GTPMetMetSubunitInitiationComplexSubunitbindingtoendofmRNAMetMetATPADP+PicomplexeIf-2因子的磷酸化状态对翻译起始复合体形成的调节控制蛋白质翻译速率eIF-2b(GEF)eIF-2~GDP必须与GTP交换，形成eIF-2~GTP交换过程需eIF-2b(GEF)参与，提高交换的速度影响eIF2释放（reuse）eIF-2~GDPeIF-2~GDP~eIF2beIF-2~eIF-2bGDPGTPeIF-2~GTP~eIF-2b起始复合体形成当eIF-2~P

对GDP~eIF-2b(GEF)亲合力高6.2.4.Geneexpressioncontrolinpost-translationlevel

Proteinsecretion(targeting)ProteindegradationPolypeptidechainfolding游离的核糖体蛋白质合成扩散在细胞质内InEuk.核糖体附着在粗糙内质网(roughendoplasmicreticulumRER)进入cis-Golgibodyinter-golgibody选择，加工，分泌，扩散tran-golgibody合成蛋白质InProk.

核糖体附着在细胞内膜（innermembrane）通过外膜合成蛋白质穿过内膜进入间质（periplasm）扩散到细胞外游离型与分泌型合成蛋白质的核糖体在结构与功能上没有差别蛋白质分泌的信号肽假说（signalhypothesis）

BlobelinProk.&Euk.1971.–197515—30aa

signalseq

inN-endofsecretoryprotein

signalS.inN-endofsecretoryprotein1—10aa15—20aa15—30aa1—3aarichArg+,Lys+richPhe,Leu,Ile…HydrophilicHelixHydrophobic&Helix信号肽切割位点反向平行，形成hairpin蛋白质分泌的信号肽假说（signalhypothesis）

signalSeq.引导的穿膜机制signalS.带正电的区段与带负电的磷脂膜互作,引导蛋白质进入innerM.+++++------------------------------------

疏水区段嵌入磷脂膜内或形成αhelix,

并对磷脂双层膜产生扰动效应，

诱发形成一个疏水性通道，以保证SignalS.所牵引的蛋白质顺利穿膜NCNC原核生物分泌性蛋白质穿膜的分子模式α-αHelixhairpingS.S.酶S.S.真核生物分泌性蛋白质穿膜的分子模式Dockingprotein72kdS.S.信号受体蛋白SRP

250kdSRPreceptor

signalS.的切除

peptidesfolding&splitting

Glucosylation

（受体对配体的识别）

Phosphorylation

（酶类的功能活化）

Acetylation(封闭N末端，改变电荷)

Methylation(改变电荷)

TransportthroughCis-GolgibodyMiddleGolgibodyTrans-GolgibodyLysosome溶酶体Transportvesicle(转运泡)Storevesiclebysignalpatch蛋白质穿膜后的加工6.2.4.2.proteindegradationa)pro