3.1 重组DNA技术的基本工具课件-高二下学期生物人教版选择性必修3

第3章第1节人教版选择性必修3（第二课时）三基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”

游离的DNA片段进入受体细胞，一般会直接被分解，就算可以进行转录并翻译成蛋白质、游离的DNA片段也无法随着细胞分裂而进行复制，导致子代细胞中不再含有目的基因。

若将目的基因插入载体，由于载体可以在细胞内复制，随着细胞分裂，载体会带着目的基因存在于每个子代细胞中。这样，基因工程才有意义。将外源基因导入细胞，通常是利用质粒作为载体。为什么不能直接将外源基因送入细胞呢？三基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”1.作用：将目的基因转入受体细胞。2.种类：通常是用质粒、噬菌体、动植物病毒也可以。①质粒：一种常用载体，大多数质粒的受体细胞是细菌。②噬菌体：受体细胞是细菌。③动植物病毒：受体细胞是动植物细胞。拟核DNA质粒大肠杆菌细胞目的基因插入位点复制原点氨苄青霉素抗性基因大肠杆菌及质粒结构模式图

质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。注意：它们的来源不同，在大小、结构、复制方式以及可以插入外源DNA片段的大小也有很大差别。三基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”3.运载体需具备的条件：①有一个至多个限制酶切点（便于插入目的基因）②能够在宿主细胞中复制并稳定地保存（自我复制或者插入到受体DNA同步复制）④有某些特殊的标记基因（便于鉴定、筛选筛含有重组DNA分子的细胞）标记基因通常有：①抗生素的抗性基因，如：抗氨苄青霉素基因(ampr)、抗四环素基因(tetr)。②荧光蛋白基因，如：绿色荧光蛋白基因(GFP)、红色荧光蛋白基因(RFP)。③对受体细胞无害，不会影响受体细胞正常的生命活动真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。三基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”标记基因的筛选原理资料卡

载体上的标记基因一般是某种抗生素的抗性基因，而受体细胞没有抵抗该抗生素的能力。将含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞，抗性基因在受体细胞内表达，受体细胞对该抗生素产生抗性。在含有该抗生素的培养基上，能够生存的是被导入了载体的受体细胞。如图所示：导入受体细胞培养加入氨苄青霉素只有含有载体，并且载体上的抗性基因表达的大肠杆菌才能存活并增殖含有氨苄青霉素抗性基因载体（如质粒）1.若用家蚕作为某基因表达载体的受体细胞，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用

作为载体，其原因是？噬菌体噬菌体的宿主细胞是细菌，而不是家蚕。病毒对宿主细胞的侵染具有一定的物种（组织）特异性。分析载体的种类和载体需具备的条件2．根据标记基因的作用，有同学认为在含有某种抗生素的培养基中筛选存活的受体细胞不一定是导入目的基因的受体细胞，这种说法是否合理？请解释。合理，因为仅导入载体的和导入插入了目的基因的载体的受体细胞均能在该培养基中存活。合作探究：三基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”请你根据图3-3中的相关信息找到两条片段上EcoRI

的识别序列和切割位点。然后，用剪刀进行“切割”。待切割位点全部切开后，将从下面那条DNA链上切下的片段重组到上面那条DNA链的切口处，并用透明胶条将切口粘连起来。…TATCGTACGATAGGTACTTAA

…ATAGCATGCTATCCATGAATTCGGCATAC…GCCGTATG……TCCTAG…AGGATCTTAAGAGCCATACTTAAAATTCTCGGTATGAATTCCATAC…

GGTATG…GAGCCATACTTAAAATTCTCGGTATG三基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”合作探究：(在G与A之间切割)EcoRI

限制酶识别序列：GAATTC1.剪刀和透明胶条分别代表哪种“分子工具”？

剪刀代表限制酶；透明胶条代表DNA连接酶。如果制作的黏性末端的碱基不能互补配对，可能是剪切位点或连接位点选得不对，也可能是其他原因。

不能，因为基因的长度一般在100个碱基对以上。2.你制作的黏性末端的碱基能不能互补配对？如果不能，可能是什么原因造成的？3.你插入的DNA片段能称得上一个基因吗？…TATCGTACGATAGGTACTTAA

…ATAGCATGCTATCCATGAATTCGGCATAC…GCCGTATG…GAGCCATACTTAAAATTCTCGGTATG三基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”思考·讨论：重组DNA技术中限制酶的选择三基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”单酶切法：获取目的基因和切割载体时，我们通常用同种限制酶，目的是为了获得相同的黏性末端，便于目的基因与载体连接。使用单酶切法的缺点是：①目的基因环化

②载体环化

③目的基因和质粒反向连接环化目的基因环化质粒环化目的基因与质粒连接目的基因11’载体22’1正向连接22’1’1’22’1反向连接思考·讨论：重组DNA技术中限制酶的选择三基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”为了避免上述情况发生，

可采取的措施是：

。分别使用两种限制酶去切割目的基因和载体选择限制酶的注意事项：1、选目的基因两端和运载体都有的酶切位点；2、所选酶切位点不能破坏目的基因以及标记基因。下列操作中选用哪种限制酶切割来构建重组质粒？图1图2BamHI

和

HindIII1.DNA连接酶是重组DNA技术中常用的一种工具酶。下列相关叙述正确的是A.能连接DNA分子双链碱基对之间的氢键B.能将单个脱氧核苷酸加到DNA片段的末端，形成磷酸二酯键C.能连接用同种限制酶切开的两条DNA片段，重新形成磷酸二酯键D.DNA连接酶只能连接双链DNA片段互补的黏性末端√2.关于基因运输工具—载体，必须具备的条件之一及理由均正确的是（）A.能够复制，以便目的基因插入其中B.具有多个限制酶切割位点，便于目的基因的表达C.具有某些标记基因，便于重组DNA的筛选D.对受体细胞无害，便于重组DNA的筛选√考点突破3.某细菌质粒上有标记基因如图所示，通过标记基因可以推知外源基因(目的基因)是否转入成功。外源基因插入的位置不同，细菌在培养基上的生长情况也不同，如图所示是外源基因插入位置(插入点有a、b、c)示意图，请根据表中提供的细菌生长情况，推测①②③三种重组后细菌的外源基因插入点，正确的一组是（

）插入点细菌在含氨苄青霉素的培养基上的生长状况细菌在含四环素的培养基上的生长状况①能生长能生长②能生长不能生长③不能生长能生长A.①是c；②是b；③是aB.①是a和b；②是a；③是bC.①是a和b；②是b；③是aD.①是c；②是a；③是b√考点突破4.图甲是含有目的基因的外源DNA片段，图乙是用于将目的基因导入受体细胞的质粒（阴影部分表示抗生素抗性基因），相关限制酶的作用部位如图所示，现欲培养转基因抗病植株，回答下列问题。（1）在基因工程的操作中，不宜选用SmaI，原因是SmaI会破坏__________和__________________________。（2）在基因工程的操作中，宜选用限制酶____________。目的基因质粒上的抗生素抗性基因PstI考点突破（3）由于反应体系中含有大量的外源DNA片段和质粒，加入PstI一种限制酶后，会得到大量的目的基因片段和质粒片段，再加入DNA连接酶后，除了会形成目的基因与质粒连接的环状产物外，还会形成______________________连接的环状产物以及_____________________连接的环状产物。质粒片段与质粒片段目的基因与目的基因限制酶DNA连接酶载体①对受体细胞无害；②有一个至多个限制酶切割位点；③有特殊的标记基因；④能自我复制或能整合到宿主DNA上。质粒、噬菌体、动植物病毒基因工程的基本工具作为载体的条件种类：磷酸二酯键来源：主要来源于原核生物特点：作用部位：具有专一性结果：形成黏性末端或平末端连接部位：磷酸二酯键种类：E.coliDNA连接酶、T4DNA连接酶作用：把两条双链DNA片段拼接起来

课堂小结四DNA的粗提取与鉴定1.实验原理：（1）提取DNA的原理：DNA、RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在差异，可以利用这些差异，选用适当的物理或化学方法对它们进行提取。DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精初步分离DNA和蛋白质DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，能溶于2mol/L的NaCl溶液溶解DNA（2）鉴定DNA的原理：在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色。通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质。

四DNA的粗提取与鉴定2.材料用具：（1）实验材料的选择：DNA含量相对较高的生物组织，如新鲜洋葱、香蕉、菠菜、菜花和猪肝等。你认为如下提供的材料中是否都适合提取DNA？为什么？洋葱香蕉猪肝菠菜猪血（注意：不能选择哺乳动物成熟的红细胞，因为哺乳动物成熟的红细胞中

没有细胞核和线粒体，几乎不含DNA。）❌四DNA的粗提取与鉴定2.材料用具：（2）试剂及用具选择：试剂：研磨液、体积分数为95%的酒精、2mol/L的NaCl溶液、二苯胺试剂和蒸馏水等。用具：烧杯、量筒、玻璃棒、研钵、纱布、漏斗、试管、试管架、试管夹、酒精灯、石棉网、三脚架、火柴、刀片和天平等。①研磨液②体积分数为95%的酒精③2mol/L的NaCl溶液④二苯胺试剂析出DNA溶解DNA鉴定DNA破坏细胞，释放出细胞内的物质，维持DNA稳定，提高DNA溶解度。研磨液成分作用Tris-HCl缓冲液稳定DNAEDTA抑制DNA酶SDS使蛋白质变性《教材》P117——附录2四DNA的粗提取与鉴定3.实验步骤：称取30g洋葱，切碎，然后放入研钵中，倒入10mL研磨液，充分研磨。研磨洋葱取材、研磨研磨目的：破碎细胞，使核物质容易溶解在研磨液中。注意：①研磨时间不宜太长，防止研磨时产生的热量影响DNA的提取量。②可在研磨液中加入纤维素酶、果胶酶，有利于充分研磨。四DNA的粗提取与鉴定3.实验步骤：取材、研磨过滤或离心方法一：在漏斗中垫上纱布，将洋葱研磨液过滤到烧杯中，在4℃冰箱中放置几分钟后，再取上清液。方法二：直接将研磨液倒入塑料离心管中，1500r/min的转速下离心5min，再取上清液放入烧杯中。思考：①上清液中除DNA之外，可能含有哪些杂质？

可能含有核蛋白、多糖等杂质②低温放置几分钟有什么作用？

抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解；

抑制DNA分子运动，使DNA易形成沉淀析出。DNA会被吸附到滤纸上而大量损失，影响最终提取的DNA量。四DNA的粗提取与鉴定3.实验步骤：方法一：在上清液中加入体积相等的、预冷的酒精溶液（体积分数为95%），静置2-3min，溶液中出现的白色丝状物就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸去上面的水分；用冷却的酒精析出DNA取材、研磨过滤或离心分离思考：①搅拌时应轻缓、并沿一个方向？

减少DNA断裂，以便获得较完整的DNA分子②酒精预冷的作用？低温可抑制核酸水解酶的活性，进而抑制DNA降解；低温抑制DNA分子运动，使DNA易形成沉淀析出；低温有利于增加DNA的柔韧性，减少断裂。方法二：将溶液倒入塑料离心管中，在10000r/min的转速下离心5min，弃上清液，将管底的沉淀物（粗提取的DNA）晾干。四DNA的粗提取与鉴定3.实验步骤：取材、研磨过滤或离心分离鉴定取两支20mL的试管，各加入2mol/L的NaCl溶液5mL。将丝状物或沉淀物溶于其中一支试管的NaCl溶液中。向两支试管中各加入4mL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min。待试管冷却后，比较两支试管中溶液颜色的变化。鉴定DNA鉴定结果对照组实验组溶液蓝色的深浅与溶液中DNA的含量的多少有关。二苯胺试剂要现配现用，用棕色瓶保存。1.利用新鲜洋葱作为实验材料提取DNA时,说法正确的是（）A.可将洋葱置于清水中，细胞吸水破裂后将DNA释放出来B.离心后上清液中加入7