(完整版)食品生物技术-3

食品生物技术-3FoodBiotechnology

基因工程的主要内容切在供体细胞内用限制性内切酶切割基因，以分离出含有特定的基因片段或人工合成目的基因并制备运载体接把获得的目的基因与制备好的运载体（质粒、病毒或噬菌体）用DNA连接酶连接组成重组体。贴把重组体引入宿主细胞检查修复筛选、鉴定出含有外源目的基因的菌体或个体第三节

基因工程在食品产业中的应用一、利用基因工程改造食品微生物二、利用基因工程改善食品原料的品质三、利用基因工程改进食品生产工艺四、利用基因工程生产食品添加剂及功能性食品第三章酶工程

与食品工业第一节

酶工程概述一、酶工程的概念

酶工程:酶的大批量生产以及利用酶的催化作用,借助工程技术手段进行物质转化,生产人们所需要产品的技术。

生物酶工程主要包括三个方面：一是用基因工程技术大量生产酶(克隆酶)，二是修饰酶基因产生遗传修饰酶(突变酶)，三是设计新酶基因，合成自然界不曾有的酶(新酶)第二节

食品酶的生产与分离纯化

一、酶的生产

从理论上讲，人们可以通过两条途径获得酶制剂，即:①化学合成；②从生物体内直接提取分离获得。酶的生产早期，人们主要是从动植物体中提取获得酶制剂。

目前仍有蛋白酶、淀粉酶、溶菌酶等少数几种酶，以动植物体为原料获得。目前酶的生产主要以微生物为原料。

近年来在合成酶的类似物和模似酶方面取得了一定进展，但它们的催化性和专一性方面都很低。所以，在较长的一段时间内，酶只有直接从生物体中提取。（一）对酶生产菌的要求

1、不能是致病菌。可用于食品的有枯草芽孢杆菌、黑曲霉、米曲霉、啤酒酵母等

2、不易退化，不易感染噬菌体。

3、产酶量高，而且最好产生胞外酶。

4、能利用廉价的原料，发酵周期短，易培养。

生产菌种的获得:除了从菌种保存机构和有关部门获得外，一般都有要通过筛选得到。筛选包括：菌样采集、菌种分离、纯化和生产性能检定。

（二）

发酵方法与发酵条件

用于酶生产的发酵方法有：1、固体发酵法

即以麸皮、米糠等为基本原料，加无机盐和适量水分(通常50％左右)进行的一种微生物培养法。用青霉、曲霉生产果胶酶；用木霉生产纤维素酶

2、液体发酵法

利用合成的液体培养基在发酵罐内进行搅拌通气培养，目前主要的方式。第四节

固定化酶

从20世纪60年代起，固定化酶研究的发展很快。初期，人们集中于各种制备方法的研究，近年，人们的注意力已开始转向固定化酶和固定化细胞在工业、医学、化学分析、亲和层析和环境保护、能源开发以及理论研究等方面的应用研究。

固定化酶：指经过一定改造后被限制在一定的空间内，能模拟体内酶的作用方式，并可反复连续地进行有效催化反应的酶。固定化酶又称固相酶。

固定化技术：是通过化学或物理等手段将酶分子束缚起来供重复使用的技术

一、

酶的固定方法

酶的固定方法有四种：吸附法共价键结合法交联法包埋法

第六节

酶工程在食品工业中的应用

一、改进啤酒生产工艺，提高啤酒质量

传统的啤酒生产主要依靠麦芽中的α、β-淀粉酶的水解作用，生成麦芽糖，进而发酵过滤等，又称全麦啤酒。传统的生产过程缓慢，效率低，难以适应现代化的要求，正逐步向外加酶制剂的方向发展。

20世纪80年代以后，耐高温淀粉酶在我国广泛推广，外加酶的范围不断扩大，已从糊化锅、糖化锅发展到前发酵、后发酵、清酒罐装等方面，啤酒生产实现了无麦芽糊化，节粮、节能显著，啤酒行业的综合经济效益得到进一步提高。多种酶的添加成为现代啤酒技术进步的一个标志。

二、

改进果酒、果汁饮料的生产工艺橘苷酶可用于分解柑橘类果肉和果汁中的柚皮苷以除去苦味，橙皮苷酶可分解橙皮苷，有效防止柑橘类罐头食品出现白色浑浊，果胶酶可用于果酒、果汁的澄清，纤维素酶可将传统工艺中的果皮渣进行综合利用，促进果汁的提取与澄清，提高可溶性固形物含量。目前已成功地将柑橘果皮渣酶解制取全果饮料，其中的纤维素经纤维素酶水解后，可转化为可溶性糖和低聚糖，构成全果饮料中的膳食纤维，具有一定的医疗保健价值。

三、食品保鲜常见的保鲜技术主要有添加防腐剂或保鲜剂和冷冻、加热、干燥、密封、腌制、烟熏等。一种崭新的食品保鲜技术---酶法保鲜正在崛起。由于酶具有专一性强、催化效率高，作用条件温和等特点，可广泛地应用于各种食品的保鲜。酶法保鲜的原理:利用酶的催化作用，防止或消除外界因素对食品的不良影响，在较长时间内保持食品原有的品质和风味。目前应用较多的是葡萄糖氧化酶和溶菌酶的酶法保鲜。

第四章

细胞工程与食品工业主要内容细胞工程的概念、研究范畴植物细胞培养动物细胞培养细胞融合技术在食品工业中的应用第一节、概述利用细胞生物学和分子生物学技术，应用工程学的方法，在细胞水平上研究改造生物遗传特性和生物学特性，从而获得特定的细胞、细胞产品或新生物品种的一门综合性科学技术。细胞工程的核心技术：细胞培养与繁殖

目的：获得新性状、新个体、新物质1细胞工程的概念及研究范畴研究范畴研究对象：植物细胞、动物细胞、微生物细胞根据改造遗传物质的不同层次可分为：大规模细胞培养细胞融合细胞拆合（核移植、细胞器移植）染色体工程胚胎工程（胚胎培养、胚胎移植）1、细胞培养细胞培养是指微生物细胞、植物细胞、动物细胞在人工提供的体外条件下进行生长和繁殖。三个层次：单个细胞培养、组织培养、器官培养微生物一般划分到发酵工程植物细胞和原生质体的培养可以用于育种，优良植株的快速生长。动物细胞培养多用于产生有价值的细胞产物，如疫苗。产品检测、疾病治疗。

1）植物细胞和组织培养技术

2）动物细胞和组织培养技术

3）细胞融合技术（体细胞杂交技术）

细胞融合是指利用人工和自然的方法将两个或几个不同亲本细胞融合成一个细胞，用于改良或创造新的物种及生产单克隆抗体。四个步骤：细胞标记---融合的细胞进行遗传标记原生质体的制备---酶法破处细胞壁诱导细胞融合---两种或两种以上细胞按一定比例置于高渗溶液，加入诱导剂或物理方法促进融合筛选杂合细胞---利用遗传标记，筛选有双亲遗传特性的的杂合细胞。

4)细胞拆合细胞拆合是指通过物理或化学的方法将完整细胞的细胞核和细胞质分离开，或将细胞核吸出来，再将同种或异种的细胞核和细胞质重新组合起来，培育成新的细胞或新的生物个体的过程，也包括各种细胞器的分离和重新组合。最早：紫外线、激光破坏细胞核，再用微吸管将其它细胞核注入后期：用微吸管将细胞核吸出，再注入其它去核细胞中，进行融合。4）细胞拆合－核移植技术5）染色体工程技术

染色体工程是按人们的需要来添加、削减或替换生物的染色体从而定向改变遗传特性和选育新品种的一种技术。主要分为动物染色体工程和植物染色体工程.动物染色体工程主要采用对细胞进行微操作的方法(如微细胞转移方法等)来达到转移基因的目的.植物细胞工程目前主要是利用传统的杂交回交等方法来达到添加、消除或置换染色体的目的

。6）胚胎工程技术胚胎工程技术是一项综合性繁殖生物学技术，主要包括体胚胎移植和分割技术、卵母细胞体外成熟和移植技术、胚胎冷冻保存、克隆动物及临床移植治疗疾病7）干细胞和组织工程8）细胞培养生物反应器2、植物细胞工程的应用紫杉醇(taxol)是从红豆杉属(TaxusL.)植物中分离出的一个具有独特抗肿瘤活性的二萜类化合物，现已应用于临床治疗卵巢癌和乳腺癌。三、动物细胞工程的应用1.在疫苗生产上的应用

。将乙型肝炎表面抗原基因插入哺乳动物细胞内进行高效表达，已生产出乙型肝炎疫苗。2.生产单克隆抗体

单克隆抗体可以检测出多种病毒中非常细微的株间差异，鉴定细菌的种型和亚种。3.繁育优良品种。

目前，人工受精、胚胎移植等技术已广泛应用于畜牧业生产。4.在干扰素生产上的应用

是指动物、植物和微生物细胞在体外无菌条件下的生长、分裂和繁殖，并在培养过程中不再形成组织的一项技术。细胞培养第二节、植物细胞培养技术一、植物细胞工程的发展

细胞学说的创立：1838～1839年间由德国的植物学家施莱登（Schleiden）和动物学家施旺（Schwann）所提出,直到1858年才较完善。理论基础和探索

1902年，德国著名植物生理学家Haberlandt,提出细胞全能性学说，并首次进行高等植物的细胞培养实验，但细胞未能发生细胞分裂和增殖。

1756年，Moncean首先发现植物在受伤愈合的组织皮层能产生芽，因而预言这一途径可以成为一种繁殖方式培养技术建立植物细胞培养技术应用发展

20世纪40年代：J.Bonner银胶菊组织培养生产橡胶。

20世纪70年代：植物细胞培养生产药用成份。

20世纪80年代：400多种植物，600多种代谢产物。40多种植物次生代谢产物达到或超过植株产量。

20世纪90年代：1000多种植物。1.首先，要取材和除菌。用一定的化学试剂对材料进行严格的表面清洗、消毒。有时还要借助某些特定的酶，对材料进行预处理，以期得到分散生长的细胞。

常用的消毒灭菌剂:效果较好的有几种化学试剂，如次氯酸钙、次氯酸钠和氯化汞等。二、细胞培养一般步骤

2.其次，根据各类细胞的特点，配制细胞培养基，对培养基进行灭菌或除菌。采用无菌操作技术，将生物材料接种于培养基中。3.最后，将接种后的培养基放入培养室或培养箱中，提供各类细胞生长所需的最佳培养条件。当细胞达到一定生物量时应及时收获或传代。三.植物细胞培养基 植物细胞的培养基:通常包括无机盐、碳源、维生素、生长调节素、有机添加剂等。用于植物细胞培养的基础培养基营养成分基本上与整个植物的要求一样，但是用于培养细胞、组织和器官的培养基要满足各自特殊的要求培养中的细胞对蔗糖和葡萄糖都能利用，果糖的利用效果较差。培养基中的蔗糖可迅速分解成葡萄糖和果糖，葡萄糖首先被利用，然后再利用果糖。也可采用其它糖作能源，但效果不佳。碳源和能源培养中的植物细胞都需要硫胺素，加入烟酸、泛酸、生物素和叶酸，效果更好。原生质体培养通常需要大多数必需维生素。维生素 虽然植物细胞在培养过程中一般都能合成所需的氨基酸，但加入L-谷氨酰胺或其他氨基酸混合物是很有好处的。此外，还使用蛋白酶解产物，如酪蛋白或酪蛋白水解氨基酸。其它有机添加剂还有如乳蛋白水解物，酵母提取物等氨基酸 激素分为两类，生长素和分裂素。生长素促进细胞生长，最有效和最常用的是吲哚乙酸和萘乙酸；分裂素促进细胞分裂，常用的是腺嘌呤衍生物。使用最多的是6-苄氨基嘌呤和玉米素，对芽的诱导具有重要作用。分裂素和生长素通常一起使用，来促进细胞的分裂、生长。植物生长激素四.愈伤组织和悬浮细胞培养技术愈伤组织：是指外植体组织增生的细胞产生的一团不定型的疏散的排列的薄壁细胞，是分化的，而且还未形成组织的结构。外植体：是指植物组织培养中用来进行离体培养的植物材料。

愈伤组织的诱导①选择适宜的外植体：幼胚、下胚轴、子叶②选择适宜的培养基：MS，B5，N6较高激素浓度丰富的有机附加物。培养基中有较高含量的无机氮源较低的蔗糖浓度③适当缩短继代培养的间隔时间有利于疏松易碎愈伤组织的形成。要求：松散性好、增殖快、再生能力强。其外观一般是色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色，呈细小颗粒状，疏松易碎适宜悬浮培养适宜再生植株高表达细胞系的筛选建立一是悬浮培养物分散性好，外观疏松、色泽鲜艳二是均一性好三是生长速度快、次生代谢产物合成能力强五.单细胞培养技术机械法将叶肉组织研碎，经过滤和离心，收集和净化细胞。优点：不受酶的伤害，有利于细胞生理和生化研究。缺点：手工操作难度大，获得完整的细胞数量少。1、单细胞分离方法酶法利用果胶酶、纤维素酶处理植物叶片或其他外植物体，使细胞分离。加渗透压保护剂如甘露醇以防酶对细胞的损伤。加硫酸葡聚糖钾盐可提高游离细胞的产量。化学法利用利用化学药剂使细胞分离的方法。

草酸钙处理胡萝卜悬浮细胞培养物时，可获得分散细胞。

秋水仙碱、2，4－D或LH。看护培养2、单细胞培养方法

用一块活跃生长的愈伤组织来促进培养细胞持续分裂和增殖的方法。优点：简便易行，效果好。缺点：不能在显微镜下追踪细胞分裂、生长过程。平板培养将悬浮单细胞与融化的琼脂培养基均匀混合后平铺一薄层在培养皿底上的培养法。平板培养植板率优点： 单细胞在培养基中分布均匀，便于在显镜下对细胞进行定点观察。筛选效率高、筛选量大、操作简便。缺点： 通气状况不好，排泄物质易积累造成毒害或影响组织吸收。在人工制造的无菌小室中，将一滴悬浮细胞液培养在少量培养基上，使其分裂增殖成细胞团的方法。微室培养优点： 可对培养细胞连续进行显微观察，了解一个细胞的生长、分裂、分化等过程。缺点： 培养基少，营养和水分难以保持，pH变动幅度大，培养细胞仅能短期分裂。六.提高植物细胞次级代谢产物含量的方法加入前体物或诱导物 前体物：次生代谢合成途径中的某一中间化合物或是合成的起始物。 诱导物：一类能引起植物细胞代谢强度变化或代谢途径改变的物质。植物细胞大规模培养在食品工业中的应用（1）利用植物细胞工程生产香料（2）生产食品添加剂（3）生产天然食品

七、植物细胞大规模培养植物细胞大规模培养的特点①植物细胞对剪切力敏感。

②植物细胞培养通常形成细胞团。③植物细胞生长速度慢，操作周期长④多泡沫。⑤植物细胞在高浓度培养时为假塑性流体。⑥植物细胞的需氧量要比微生物要低的多。⑦大多数植物细胞培养需要光照。1.植物细胞悬浮细胞培养悬浮细胞培养技术悬浮培养优势把离体的植物细胞悬浮在液体培养基中进行增殖培养1）培养细胞与培养基质接触面大，传质效果好。2）可带走有害的代谢产物，避免了有害产物局部浓度过高的问题。3）能充分保证氧的供给。2.植物细胞固定化培养植物细胞固定化是将植物细胞包裹于一些多糖或多聚化合物上进行培养，并生产有用代谢物的技术。固定化培养技术（1）有利于次生物质的合成、积累；（2）减弱剪切力损伤；（3）有利于连续培养和产物的收集；固定化培养优势

1）悬浮培养生物反应器

植物细胞大规模培养的初期（20世纪70年代），主要采用微生物培养用的机械搅拌反应器。1972年，Kato首先用机械搅拌反应器培养烟草细胞以获取烟碱。Fujita利用这种反应器生产紫草宁。3.植物细胞培养生物反应器机械搅拌反应器机械搅拌植物细胞反应器机械搅拌反应器的优点及存在的问题优点：机械搅拌生物反应器最大的优点就是获得高的溶氧系数(KLa＞100h-1)，植物细胞培养一般只需要KLa在5-20h-1之间就够了；再是反应器的温度、pH值、溶氧及营养物质的浓度较易控制。存在的问题：主要问题是剪切力问题；对只需较低kLa的植物细胞培养，促进氧传递的机械搅拌，每单位体积消耗的功率比气体搅拌要大；机械搅拌需搅拌轴，由此又带来了无菌密封问题。非机械搅拌反应器通常为气体搅拌反应器，是一种利用通入的空气作通气和搅拌的生物反应器，主要有鼓泡式反应器和气升式反应器，气升式反应器又可分为外循环和内循环式。我国的刘大陆、查丽杭等发明了“气升内错流式”植物细胞培养反应器用于培养紫草，紫草宁含量达到了干细胞重的10%，是天然植株的2-8倍。气体搅拌反应器的优点及存在的问题优点：剪切力小，对植物细胞损伤小；因没有搅拌轴而更易保持无菌；操作费用低。不足：因气体搅拌强度低，高密度培养时混合不够均匀。靠大量的通气输入动量和能量，以保证反应器内培养液的良好传质、传热。但过量的通气易排除培养液中的二氧化碳和乙烯，对于细胞生长有阻碍作用。再是过高的溶氧对植物细胞合成次级代谢产物不利。2)固定化细胞生物反应器

固定化细胞：将一定生理功能的生物体用物理或化学方法使其与适当载体相结合，作为固体催化剂利用。优点：单位体积细胞多，受剪切力小。缺点：由于其混合效果低，对必要的氧传递，pH值、温度控制和气体产物(如C02)的排除造成了困难。再者支持物颗粒破碎易堵塞填充床。填充床反应器Jones在填充床反应器中进行了固定化胡萝卜的培养，Kargi采用这种反应器培养长春花流化床反应器优点：良好的传质特性。缺点：剪切力和颗粒碰撞会损坏固定化细胞，同时，流体动力学的复杂性使之难以放大。典型的流化床反应器是利用液体或气体的流动使支持物颗粒处于悬浮状态。Hamilton用之培养胡萝卜细胞，研究了转化酶活性。膜反应器优点：可以重复使用。另外，流体易控制，易放大，而且能提供更均匀的环境条件。膜具有选择性，有利于产品分离。缺点是构建膜反应器的成本较高。第三节、动物细胞培养技术

19世纪30年代，Muller,Schwann,Virchow等相继在肺结核、天花、水痘、麻疹等病理组织中观察到多核细胞现象。1849年Lobing在骨髓中也发现了多核现象的存在，1855年～1858年，科学家们在肺组织和各种正常组织及发尖和坏死部位都发现了多核细胞。

1．融合现象的发现一、动物物细胞工程的发展1859年，A.Barli在研究黏虫的生活史时发现，某些黏虫存在着由单个核细胞融合形成多核的原生质团的情况。据此，他认为多核细胞是由单个细胞彼此融合而形成的。2.动物组织细胞培养技术的建立 1907年，R.Harrison将蛙的胚神经管区的一片组织移植到蛙的淋巴液凝块中，这片组织存活了若干星期，而且还长出了轴突(神经纤维)细胞。 Carrel(1911)发现了鸡胚浸出液对于某些细胞的生长具有很强的促进效应，把无菌技术引到了组织培养技术中。1914年，Thomson创立了器官培养法，以后被Strangeways和Fell所发展。1940年，Earle建立了小鼠的结缔组织细胞系－L系。1951年，Gay建立了第一个人体细胞系.3.细胞融合技术的建立和杂交瘤技术的诞生 1958年,Okada发现紫外灭活的仙台病毒可引起艾氏腹水瘤细胞彼此融合。 Harris(1965)诱导不同的动物体细胞融合获得成功。Lifflefield(1964)根据亲本细胞的酶缺陷型，利用选择性培养基筛选异型融合细胞，并能不断地增殖。 1975年，免疫学家Kohler和Milstein利用小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，选择到能分泌单一抗体的杂种细胞。4.动物克隆技术的建立 1891，Heape等人首次报道了家兔胚胎移植成功的结果。 20世纪30年代以后，先后在羊、猪、牛等动物的胚胎移植上获得成功。

1962年，英国学者Grudon把非洲爪蟾小肠上皮细胞的核注入同种或异种非洲爪蟾未受精卵(经紫外线照射杀死卵细胞核)中，约有1％的重组卵发育成为成熟蛙。 1997年2月，英国科学家Wilmut等报道了世界第一只克隆羊的诞生。1.过程二、动物细胞培养2.几个概念：动物细胞培养就是从动物机体中取出相关的组织,将它分散成单个细胞,然后,放在适宜的培养基中,让这些细胞生长和增殖,并维持结构和功能的一门技术。动物细胞培养 将动物组织消化后的初次培养称为原代培养。原代培养和传代培养 用胰蛋白酶将出现接触抑制的贴壁细胞从培养瓶壁上脱离下来，制成细胞悬液，分装到多个培养瓶中继续培养，这个过程叫传代培养。细胞系和细胞株 初次培养的细胞经第一次传代成功后，即称之为细胞系。 从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选方法，由单细胞增殖形成的细胞群，称细胞株。有限细胞系和无限细胞系 大多数细胞系在有限的代数内增殖，当超过有限世代后，它们可能有两种情况，一是衰老死亡，二是发育成无限细胞系或称连续细胞系。有限细胞系转换成永久细胞系的过度期称为转换期，其转换过程在动物细胞培养中称为体外转化。

接触抑制密度抑制3.动物细胞培养生长的特点贴附生长贴附生长

粘附型细胞:附着在某一固相支持物表面才能生长的细胞。 悬浮型细胞:不必附着于固相支持物表面，而在悬浮状态下即可生长的细胞。绝大多数有机体细胞属粘附型细胞，只有少数细胞类型如某些肿瘤细胞和白细胞可在悬浮状态下生长。细胞接触抑制细胞在贴壁生长过程中，细胞间相互接触，细胞分裂和生长停止的现象。密度抑制

细胞培养过程中，细胞密度增大，培养液中营养成分减少，代谢产物增多，细胞因营养的枯竭和代谢物的影响而导致的细胞分裂和生长停止。细胞在体内、外的粘附方式存在差异体内：粘附是全方位，外形具有复杂的立体特征体外：多数情况，细胞只有一个附着平面，外形一般与体内时明显不同上皮细胞型成纤维细胞型游走细胞型多型性细胞型4、培养动物细胞形态 类似体内的上皮细胞，扁平，不规则多角形，中有圆形核。彼此紧密相连成铺石状薄层；生长时呈膜状移动；很少脱离细胞群而单个活动上皮细胞型 胞体梭形或不规则三角形；胞质向外伸出2—3个长短不等的细胞突起；中有卵圆形核。排列成放射状，漩涡状，不连成片。成纤维细胞型游走细胞型

外形不规则且不断变化，细胞内容易出现暗的吞噬性颗粒。生长位置不固定，分散，呈活跃的的游走和变形运动。多型性细胞型

外形不规则，细胞由略呈多角形的胞体和细长的、类似伪足的胞突两部分组成，胞内容易出现暗的吞噬性颗粒血清：如Hela细胞系在高血清－成纤维细胞样；低血清－上皮样细胞pH：如Hela细胞系，太酸或太碱－成纤维细胞样；标准pH－上皮样细胞

细胞密度：3T3，低密度－成纤维细胞样；高密度－上皮样细胞

生长状态改变：悬浮－圆形悬浮；贴附－成纤维或上皮样

转化与否：未转化成纤维样；转化后－可成上皮样培养细胞形态变化三、培养细胞的生长和增殖过程1.培养细胞生命期

所谓培养细胞生命期，是指细胞在培养中持续增殖和生长的时间。包括原代培养期、传代培养期及衰退期。正常培养的细胞周期2.体外培养细胞一代生存期-生长曲线潜伏期指数增长期平衡期衰退期所谓细胞的“一代”是指从细胞接种到分离再培养的一段时间。四、动物细胞培养的基本技术1.无菌、无毒的环境添加一定量的抗生素，定期更换培养液。2.温度和pH温度pH与体内相近35-37℃7.2~7.43.气体环境O2CO2细胞代谢所必需维持pH

CO2培养箱（95%空气＋5%CO2

）5.平衡盐溶液BSS 人工合成培养基的基础用液，用来洗涤细胞。 Hanks液、Earle液和PBS液等4.营养物质糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素、激素以及动物或人血清等。培养方式分为：分批式流加式半连续式连续式1.动物细胞大规模培养工艺方式五、动物细胞大规模培养

分批式培养

分批式培养：指先将细胞和培养液一次性装入反应器内进行培养，细胞不断生长，产物不断形成，经一段时间后，终止培养。特点：分批式培养过程的环境随时间变化很大细胞的生长阶段可分为延滞期、对数生长期、减速期、平稳期和衰退期。

流加式培养

特点：可避免某种营养成分的初始浓度过高；能防止营养成分在培养过程中被耗尽；整个过程反应体积是变化的。

流加式培养是指先将终体积1/3~1/2的培养液装入反应器，接种细胞，进行培养，在培养过程中，随着细胞对营养物质的不断消耗，新的营养成分又不断补充至反应器内，使细胞持续生长代谢，到反应终止时取出整个反应系。半连续式培养

指在分批式培养的基础上，将分批培养的培养液部分取出，并补充加入等量的新鲜培养基，使反应器内培养液的总体积保持不变。半连续培养能够重复获得大量均一的培养细胞供进一步利用。特点：操作简便、生产效率高，可长期生产，细胞密度和产品产量一直保持在较高水平。连续式培养

连续式培养：指在培养过程中，以不断抽取悬浮培养物并注入等量新鲜培养基，使培养物不断得到养分补充，保持反应条件处于一种恒定状态。 特点：（1）反应器培养状态恒定，保持细胞在优化状态下生长；

（2）适于大规模工业化生产； (3)操作复杂、增加污染机会、细胞变异、设备仪器要求高

2、动物细胞大规模培养技术悬浮培养贴壁培养固定化培养

微载体培养技术大载体培养技术多孔载体培养微囊化培养技术中空纤维细胞培养技术第三节细胞融合技术 是指在外力的作用下，两个以上的异源（种、属）细胞或原生质体互相接触，不经过有性过程而发生膜融合、胞质融合和核融合并形成一个杂合细胞的现象。细胞融合（体细胞杂交）

白菜甘蓝白菜－甘蓝植物体细胞融合应用示例杂交的两个细胞用纤维素酶、果胶酶处理细胞壁原生质体Ａ、Ｂ经离心、振动、电刺激用聚二乙醇（ＰＥＧ）诱导融合后的原生质体再生细胞壁杂种细胞脱分化细胞分裂愈伤组织杂种植株再分化（植物体细胞融合完成的标志）植物细胞融合植物组织培养 细胞在促融因子的作用下，出现凝集现象，然后，细胞之间的质膜发生粘连，细胞开始细胞质融合，然后在培养过程中，进而发生核融合，形成杂种细胞。细胞融合的过程细胞融合一.诱导细胞融合的方法1、病毒诱导细胞融合 病毒是最早采用的融合剂。常用于诱导动物细胞融合的病毒有仙台病毒、新城鸡瘟病毒、疱疹病毒等，其中仙台病毒最常用。 用作融合剂的病毒必须事先用紫外线或β-丙内酯灭活，使病毒的感染活性丧失而保留病毒的融合活性。两个原生质体或细胞在病毒黏结作用下彼此靠近，使两个细胞膜、胞质间互相渗透、细胞核互相融合，进入正常的细胞分裂途径，形成杂种细胞。机制优点：融合率较高，适宜各种动物细胞，且仙台病毒能在鸡胚中大量繁殖，容易培养；缺点：仙台病毒不稳定，在保存过程中融合活性会降低，并且制备过程比较烦琐。此外，病毒引进细胞后，可能会对细胞的生命活动产生干扰。病毒诱导融合优缺点 利用化学融合剂，促使原生质体相互靠近、粘连融合的方法。2、化学融合剂法

1981年，Scheurich和Zimmermann发明了电诱导细胞融合。

采用直流电脉冲的诱导，可改变原生质体质膜表面的电荷，使异种原生质体粘合，并使原生质膜瞬间破裂，相邻的原生质体连接、闭合、产生融合体。

3、电诱导细胞融合法细胞电融合原理：

悬于大小不同的两平行电极间的低导电率溶液中的细胞，在交流电场中（1—100MHz和100—1000V/cm），会向小电极移动，并极化成偶极子，并沿电场方向排列成串，此时再加上适当强度和持续时间的高压电脉冲，即可使相邻细胞膜的接触区产生可逆电降解，从而触发细胞融合。

①电泳：在电极的作用下，原生质体泳到一起，建立一个膜接触状态，形成念珠链。

②融合：由于膜的可逆性电激穿，使原生质体发生融合。电融合包括两个步骤：原生质体电融合过程1）在高频电流电场下的相互接触。2）脉冲刺激后30s

3)50秒后4）1.5分钟后5）6分钟后6）15分钟后，原生质体融合完成。优点：融合率高，达70％－80％，甚至100％可在显微镜下定向诱导细胞融合可直接挑选杂种细胞重复性强、对原生质体伤害小；装置精巧、方便简单；免去PEG诱导后的洗涤过程、诱导过程可控制性强等。缺点：必须购置专用的细胞电融合设备。离子束诱导细胞融合 在离子束与生物体相互作用中，粒子的植入、动量的传递和电荷交换可导致细胞表面被刻蚀，引起细胞膜透性和跨膜电场的改变，据此原理，发展了离子束诱导的细胞融合二、植物细胞融合原生质体 原生质体是指用特殊方法去除细胞壁后而形成的祼露的、有生活力的原生质团。植物原生质体的制备流程原生质体的分离原生质体的纯化鉴定取材与消毒洗涤活力测定1、取材与消毒 可以用各种组织和器官，但多应用叶片、愈伤组织及悬浮培养细胞。以及茎尖、根尖、子叶和胚性组织。肥皂水－70%酒精－3%次氯酸钠－无菌水先将细胞放在高渗糖溶液中预处理，待细胞发生轻微质壁分离，原生质体收缩成球形后，再用机械法磨碎组织，从伤口处可释放出完整的原生质体。缺点：获得完整的原生质体的数量比较少，能够用此法产生原生质体的植物种类受到限制。优点：该方法可避免酶制剂对原生质体的破坏作用。2、原生质体的分离机械分离法指将材料放入能降解细胞壁的混合等渗酶液中保温一定时间，在酶液的作用下，细胞壁被降解，从而获得大量有活力的原生质体的方法。酶解分离法优点：获得量大，适用广泛。缺点：商品酶制剂均含有核酸酶、蛋白、过氧化物酶以及酚类物质。会影响所获原生质体的活力。3、原生质体的纯化采用比原生质体密度大的高渗溶液（蔗糖、Percoll、Ficoll），使原生质体漂浮在液体表层的纯化方法。优点：可以避免分离的原生质体因震荡被组织碎片撞击而破损；所用药品简单，成本低。缺点：对离心力要求比较严格，掌握不好，原生质体则不易漂浮。飘浮法沉降法（过滤－离心法）利用比重原理，在具有一定渗透压的溶液中，先进行过滤然后低速离心，使纯净完整的原生质体沉积于试管底部。优缺点：纯化原生质体比较简单。由于原生质体沉积于试管底部，造成相互挤压，常引起原生质体的破碎。不连续梯度法又称界面法，采用两种密度不同的溶液形成不连续梯度，通过离心使原生质体与破损细胞分别处于不同液相中，从而纯化原生质体的方法。优点：可以收集到数量较大的纯净原生质体，同时避免收集过程中原生质体因相互挤压而破碎。4、原生质体活力测定－形态识别形态完整、富含细胞质、颜色新鲜的正常球形，放入低渗溶液中，可正常膨大。形态识别荧光显微镜识别(FDA法)

FDA(fluoresceindiacetate)不发荧光也不具有极性，能自由穿过细胞质膜。活细胞内FDA可以被内酯酶水解为不能自由穿越质膜的荧光素，在完整的活细胞内积累。使用浓度：0.01%酚藏花红染色法酚藏花红（0.1%)能使无活力的原生质体染成红色，有活力的原生质体不着色。 有活力但受损伤的细胞和死细胞能够摄取伊凡蓝(Evan’sblue)(0.025%)这种染料，活细胞不摄取。伊凡蓝染色法5、植物细胞融合PEG法和电融合法比较合适6、融合子的鉴别根据两亲本原生质体的形状和结构的差异来鉴别杂合体。如一方细胞基本无色，另一方为绿色，则白绿色结合的细胞就是杂合细胞根据可见标记性状的机械选择法显微鉴别。

FITC(异硫氰酸荧光素)在荧光显徽镜下呈绿色RITC(异硫氰酸罗丹明)在荧光显徽镜下呈红色荧光标记

互补选择法是指利用两个亲本具有不同遗传和生理特性,在特定培养条件下,只有发生互补作用的杂种细胞才能生长的选择方法。互补选择法优质植物快速培育与繁殖动物胚胎工程快速繁殖优良、濒危品种利用动植物细胞培养生产活性产物、药品。新型动植物品种的培育。在医学器官修复或移植中的应用。制备转基因动植物的生物反应器。珍稀动植物资源的保存与保护。在遗传学、发育生物学等领域的理论研究。在能源、环境保护等领域的应用细胞工程技术的应用

第五章

发酵工程与食品工业一、基本概念1、发酵-fermentation

词源于拉丁文的“fervere”，指酵母作用于果汁或麦芽汁而表现出来的沸腾现象，是糖厌氧发酵产生二氧化碳的结果。1857年法国微生物家巴斯德提出了著名的发酵理论：“一切发酵过程都是微生物作用的结果。”

工业上的发酵定义：任何通过大规模培养微生物来生产产品的过程都是发酵。第一节

概论2、发酵工程——fermentationengineering

概念

采用现代工程技术手段，利用微生物的某些特定功能，为人类生产有用的产品，或直接把微生物应用于工业生产过程的一种新技术。

发酵工程是一门综合性的学科，包括微生物学、化学工程、基因工程、细胞工程、机械工程和计算机软硬件工程

研究对象——微生物、动物细胞、植物细胞研究内容

1.菌种的选育、保藏、复壮和扩大培养2.发酵培养基的选择、制备和灭菌3.发酵过程的工艺技术控制4.发酵产物的分离提纯典型的发酵生产过程包括：

确定菌种繁殖和发酵生产所用的培养基；

对培养基、发酵罐及其附属设备进行灭菌；

菌种经逐级扩大培养后，作为生产种子接种于发酵罐中

菌种的选育产物萃取和精制

发酵过程中废弃物的处理与回收控制发酵罐中微生物的生长条件，最大程度地获得人们渴望的代谢产物

3、发酵的类型

按照是否需氧，发酵分为好氧和厌氧两大类，是否需氧是由所使用的细胞或菌株的代谢特性决定的。

好氧发酵(aerobicfermentation)发酵过程需要氧气。多数有机酸，如醋酸、柠檬酸和各种氨基酸的发酵生产菌需要氧气。发酵所需的氧气是以无菌空气方式供给的。不断搅拌促进氧气进入发酵液。

厌氧发酵(anaerobicfermentation)发酵过程无需氧气，不搅拌。酵母菌酿酒，乳酸菌生产乳酸，瘤胃细菌分解纤维素过程不需要氧气。

按照使用的细胞类型，发酵分为：

微生物发酵：

植物细胞发酵；

动物细胞发酵。

动植物细胞的发酵历史很短。通常所说的发酵主要是指微生物发酵。4、发酵的意义

1.获得用其它方法不易获得的物质

酒精等有机物质，生物碱、激素、酶、蛋白质、核酸、复杂的多糖等物质至今要靠发酵来获得。化学合成的成本太高，有些物质目前还不能化学方法合成，例如有旋光活性的氨基酸，D、L型的挑选要用酶的立体专一性解决。用化学方法生产酶至少现在几乎不可思议。

2.获得菌体

有些微生物菌体，如人体所需的双歧乳酸菌，是以活的菌体为需要对象。

3.转化为用其它方法不能或不易转化的物质

自然界第一位的材料是纤维素。目前纤维素的分解主要靠生物分解。牛、羊瘤胃中细菌分解纤维素的能力是化学方法无法相比的，这样的转化产物是乳汁且无污染，而化学方法最多的转化产物是纸以及造纸所产生的大量有污染的废水。

天然发酵阶段（古代-1900年）纯培养技术的建立（1905年-）通气搅拌发酵技术的建立（1940年-）开拓发酵原料时期（1960年-）基因工程阶段（1979-）二、发酵工程的发展历史1、发酵工程的早期阶段1900年以前，发酵产品只限于含酒精饮料和醋；古埃及已经能酿造啤酒，

17世纪能在容量为1500桶（一桶相当于110升）的木质大桶中进行第一次真正的大规模酿造

人们的对发酵技术的认识起始于19世纪末，主要来自于厌氧发酵，如利用酵母菌、乳酸菌生产酒精、乳酸和各种发酵食品。

1916年英国采用梭状芽孢杆菌生产丙酮丁醇，德国采用亚硫酸盐法生产甘油(第一次世界大战)——

由食品工业向非食品工业发展

好氧发酵技术：速酿法从乙醇生产醋酸，通气法大量繁殖酵母，用米曲霉的麸曲代替麦芽糖作糖化剂生产酒靖，用微小毛霉生产干酪。

1933年等人发明了摇瓶培养法代替了传统的静置培养法。生长均匀，增殖时间短。2、青霉素的发现是发酵工程的重大转折点

1928年由Fleming发现青霉素

1941年美国和英国合作对青霉素进行生产研究表面培养：1升扁瓶或锥形瓶，内装200mL麦麸培养基─40u/ml

1943年沉浸培养：5m3——200u/ml

当今：100-200m3——5-7万u/ml，

链霉素、金霉素、新霉索、红霉素

主要的技术进展：

通气搅拌解决了液体深层培养时的供氧问题。

抗杂菌污染的纯种培养技术：无菌空气、培养基灭菌、无污染接种、大型发酵罐的密封与抗污染设计制造。

意义：

抗生素工业的发展；

建立了一套完整的好氧发酵技术，大型搅拌发酵罐培养方法；

推动了整个发酵工业的深入发展；

为现代发酵工程奠定了基础3、分子生物学与发酵工程

氨基酸发酵工业——谷氨酸、赖氨酸

核酸发酵工业——肌苷酸、乌苷酸

微生物变异株通过代谢调节——代谢控制发酵技术

切断支路代谢转折点:酶的活力调控，酶的合成调控(反馈控制和反馈阻遏)→解除菌体自身的反馈调节，特殊调节控制的利用，突变株的应用，前体、终产物、副产物等4、20世纪70年代——细胞融合技术、基因操作技术等生物技术发展，打破了生物种间障碍，能定向地制造出新的有用的微生物：

增加微生物体内控制代谢产物产量的基因拷贝数，可以大幅度地提高目标产物的产量

将动、植物或某些微生物特有产物的控制基因植入细胞中，快速经济地大量生产这些产物

将具有不同性能的多种质粒植入，使新菌株在清除污染或以非粮食物质为原料进行发酵生产或环境保护这个阶段以基因工程产品的生产为标志。目前，世界上已经批准上市的基因工程药物就有几十种，如：胰岛素、人生长激素等等。

阶段主要产品控制要求菌种来源自然发酵阶段（1900以前）制曲酿酒、制醋、酿制酱油、泡菜、沤肥等温度计、比重计、热交换器纯培养物重培养发酵阶段（1900-1940）面包酵母、甘油、柠檬酸、丙酮-丁醇等pH离线控制、温度纯培养技术深层通气发酵阶段（1940-1957）抗生素、有机酸、酶制剂、维生素、激素等温度、pH突变、筛选代谢调控发酵阶段（1957-1960）氨基酸、核苷酸温度、pH、诱变全面发展阶段（1960-1979）单细胞蛋白计算机控制菌株遗传工程技术基因工程阶段（1979-today）为生物自身不能产生的物质，如干扰素、胰岛素计算机控制基因重组技术发酵工业的发展阶段5、发酵工程产业化发展

目前，全球发酵产品的年销售额在400亿美元左右，并以每年约7-8%的速率增长。

我国发酵行业生产企业有5000多家，主要发酵产品的年产值达1300亿元。

随着人类社会经济发展，当前的能源结构、资源结构、环境状态已不能支撑现有的发展模式。

煤、石油等能源的耗竭以及环境保护的急需。

发酵工程给人类社会的生产力发展带来了巨大潜力，涉及到解决人类所面临的食品与营养、健康与环境、资源与能源等重大问题

基于碳氢化合物的经济转变为基于碳水化合物的经济，将工业革命世纪转变到生物技术世纪

只有工业微生物才能将来源于太阳能的可再生资源碳水化合物转变为现代社会所需要的化工原料和能源。这种能源结构和资源结构的转变直接关系到我国经济的可持续发展，社会的稳定、和国家安全。

21世纪是生物技术世纪

未来科学家说：21世纪是生物技术世纪；科学家预言：21世纪世界即将在生物技术上取得重大突破，新世纪之初，科学方面的主要将在生物学、遗传学和医学、新型生物材料、能源、环境保护上有所突破；经济学家则认为：21世纪20年代，生物经济将由目前的形成阶段进入成长阶段，即工业生产与商业开发阶段。

我国的情况转录组学

蛋白质组学

代谢组学

通量组学

计量生物学三、发酵工程的工艺流程发酵生产的设备

发酵罐又叫反应器，有通风和嫌气两类。前者用于好氧发酵，后者用于厌氧发酵。也有同时适合于两种类型的发酵罐。

物料处理和运输设备

如磨碎机、筛选机、输送机等，用于将原料粉碎和传输至发酵罐。

空气调节和除菌设备

调节空气的湿度、温度和除去空气中的微生物。

过滤与分离设备

如过滤机，离心机等用于发酵成熟液的过滤、澄清；产物的分离。

浓缩干燥结晶设备

用于分离后获得的初品的再处理。

发酵的工艺控制

发酵过程需在以下方面监控，这些指标已经实现在线自动化。

1.温度

升、降温度是通过发酵罐的夹套或换热蛇管（排管）中的蒸汽或制冷剂，与发酵液进行热交换实现的。

2.溶氧

通风搅拌增加溶解氧

3.pH

调节方法为加酸、碱或稀释。

以上三项使用传感器监控。

4.泡沫

发酵过程产生过多泡沫会影响发酵正常进行，加入消泡剂可以减少泡沫生成。

5.中间产物

要使微生物和动植物细胞的代谢朝着所需的方向进行，应用细胞代谢调控知识引导，否则会出现过多的副产物。

6.杂菌污染

非发酵使用的微生物会随时进入发酵罐。确保菌种扩大期间无杂菌培养是最关键的一步。发酵期间杂菌污染要及时发现和消除。应用发酵工程的生产实例

谷氨酸是鲜味剂味精的主要成分，以前用植物(如大豆)蛋白质水解法生产。1957年，日本率先用微生物发酵法生产成功。常用的谷氨酸产生菌有谷氨酸棒状杆菌、黄色短杆菌等。培养基通常用豆饼(或马铃薯等)的水解液、玉米浆、尿素、磷酸氢二钾、氧化钾、硫酸镁、生物素等配制而成，呈液体状态，因此也称培养液。其中的生物素是生长因子。培养液配制完成以后，投放到发酵罐中，通入98kPa的蒸汽进行灭菌，冷却后，在无菌条件下加入菌种，即为接种。

发酵罐是一种圆柱形的容器，容量从几升到几百万升不等，上面连接有通气、搅拌、接种、加料、冷却等装置；此外，还有对温度、pH、通气量与转速等发酵条件进行检测和控制的装置(如图)。

谷氨酸棒状杆菌是好氧菌，因此，发酵过程要不断地通入无菌空气，并通过搅拌，使空气形成细小的气泡，迅速溶解在培养液中(称溶氧)；同时，也能使菌种与培养液充分接触，提高它们对原料的利用率。在温度为30～37℃、pH为7～8.0的条件下，经28～32h，培养液中就会生成大量的谷氨酸。最后，将谷氨酸从培养液中分离提取出来，通常每升培养液中能得到谷氨酸50～100g。提取出来的谷氨酸用适量的Na2CO3溶液中和后，再经过过滤、浓缩、离心分离等步骤，便制成了味精。

四、发酵工程的微生物学基础1、微生物(Micro-organism)的特征

定义

一切肉眼看不见或看不清的微小生物的总称通常要用光学显微镜和电子显微镜才能看清楚(有些肉眼可见，如蘑菇、灵芝)

分类

原核类：细菌、蓝细菌、放线菌；支原体、衣原体、立克次氏体

真核类：真菌、原生动物、显微藻类

非细胞类：病毒、亚病毒(类病毒，拟病毒，朊病毒)

特点：形体小(<0.1mm)；

构造简单：单细胞、简单多细胞、非细胞；

体积小，面积大；

吸收多，转化快；

生长旺，繁殖快；

适应强，易变异；

分布广，种类多。

大肠杆菌0157:H7放线菌酵母菌霉菌分生孢子弧形霍乱菌肉毒梭菌淋病球菌HIV病毒

微生物大小的直观感觉

不同微生物的增殖速率微生物名称

代时

每日分裂次数

温度

每日增殖率

乳酸菌

38分 38 25 2.7×1011

大肠杆菌

18分 80 37 1.2×1024

根瘤菌

110分 13 25 8.2×103

枯草杆菌

31分 46 30 7.0×1013

光合细菌

144分 10 30 1.0×103

酿酒酵母

120分 12 30 4.1×103

小球藻

7小时 3.4 25 10.6

念珠藻

23小时 1.04 25 2.1

硅藻

17小时 1.4 20 2.64

草履虫

10.4小时 2.3 26 4.92

突变频率一般为10-5～10-10

变异原因：

个体多为单细胞或结构简单的多细胞，甚至非细胞结构，易受到外界物理或化学因素影响

细胞增殖速度快，细胞数量多，因而尽管其自发突变率很低，也会造成在短时间内产生较多的变异后代案例：1、青霉素生产菌的诱变选育生产青霉素的产黄青霉菌，开始筛选获得时，每毫升发酵液仅含约20单位的青霉素，但经过多次诱变选育后，每毫升已超过5万单位了。2、病原微生物对抗生素的耐药性变异

40年代初至今，成人患者的青霉素注射剂量,已由每天10万单位提高到100万单位甚至上千万单位。2、发酵工程中的重要微生物

假单胞菌(Pseudomonas)

维C、抗生素

、酶及酶抑制剂、有机酸

从石油产品制造产品(水杨酸等)

消除环境污染(处理石油废水，含酚、氰和化学农药的污水等)

大肠杆菌(Escherichiacoli)基因工程宿主菌，工业上生产谷氨酸脱羧酶、天冬酰胺酶和制备天冬氨酸、苏氨酸及缬氨酸等

双歧杆菌

(Bifidobacterium)活性双歧杆菌的乳制品或微生态制剂

枯草芽孢杆菌

(Bacillussubtilis)淀粉酶、蛋白酶、5’-核苷酸酶、某些氨基酸及核苷

乳酸杆菌

(Lactobacillus)

链霉菌

(Streptomyces)

90%抗生素由链霉菌属生产，常见有：链霉素、土霉素、博莱霉素、丝裂霉素、制霉菌素、卡那霉素、井冈霉素

酵母菌

(yeast)常用酵母菌有：啤酒酵母、假丝酵母、类酵母等主要用于酿酒、制造面包、制造低凝固点石油、生产脂肪酶、酵母菌体蛋白、基因工程宿主菌等。

霉菌

(molds)工业上常用霉菌有：根霉、毛霉、犁头霉，红曲霉，曲霉、青霉等，主要用于生产多种酶制剂、抗生素、有机酸及甾体激素等。

乳酸菌酵母和醋酸菌泡菜发酵中的有益菌豆豉和纳豆的发酵菌种豆豉：米曲霉（同豆酱）纳豆：米曲霉、细菌（纳豆芽孢杆菌）腐乳的发酵菌种主要是毛霉另有根霉、米曲霉、红曲菌、酵母等酿造酱油的发酵菌种米曲霉和酱油曲霉决定酱油的发酵速度、成品颜色及味道

米曲霉（蛋白酶、谷氨酰胺酶、淀粉酶、果胶酶、半纤维素酶等）酵母菌和乳酸菌有助酱油产香（乳酸乙酯）酿造食醋的发酵菌种黑曲霉（糖化）酵母（产酒精）醋酸菌注意：黄曲霉毒素，特别是花生、大米等易生成，具有强致癌性。

黄酒厂的曲中无此毒素

五、发酵过程中的染菌问题染菌不会无缘无故，是人无意识所为；防范得当是可以把杂菌拒之门外的1、常见的染菌原因

空气带菌：过滤介质不干燥；灭菌和发酵时操作不当使罐压高于过滤器中空气压力，将冷凝水或发酵液倒灌至过滤器内；突然停电，空压机停转，也会发生倒灌。

培养基灭菌不彻底：蒸汽压力或灭菌时间不够；配料未混合均匀，存在结块现象

设备死角：设备方面特别是老设备常会遇到各种问题，如夹层或盘管、轴封和管道的渗漏；空气除菌效果差；管道安装不合理，存在死角等

排水排气：多个罐的排气管、下水管汇集在一条总管路上，相互干扰人员操作失误2、可能污染的杂菌种类

芽孢杆菌、短杆菌、长杆菌、球菌、噬菌体、酵母菌等3、染菌的判断

常用方法：镜检或无菌试验方法。局限性：初期很难镜检发现，发现后染菌已很严重；无菌试验要十来个小时，发现后再处理为时已晚。

发酵参数异常变化判断：溶氧变化规律可作为染菌预报的根据。污染好气性杂菌，溶氧会一反往常在较短时间内下降到接近零，且长时间不回升…杂菌本身非十分好气：溶氧反而升高

污染噬菌体：发酵液变稀，溶氧迅速回升

从染菌的规模来分析

大批发酵罐染菌，而且染的是同一种菌，一般是由空气过滤器失效造成的。对空气系统必须定期检查。

部分发酵罐(或罐组)染菌，发酵前期可能是种子带菌，中后期可能是中间补料系统或油管路发生问题

个别发酵罐连续染菌和偶然染菌，大多由设备问题造成(如阀门渗漏、罐体腐蚀、冷却管穿孔等)。个别发酵罐的偶然染菌原因比较复杂。

从染菌的时间来分析

发酵早期染菌：种子带菌，培养液灭菌或设备灭菌不彻底

中、后期染菌：中间补料、设备渗漏以及操作不合理

从染菌的类型来分析

染耐热芽孢杆菌：多因设备存在死角或培养基灭菌不彻底

染球菌、酵母：从蒸汽的冷凝水或空气中带来

污染霉菌：大多是灭菌不彻底或无菌操作不严格所致。4、灭菌与消毒

灭菌：用物理或化学方法杀死或除去环境中所有微生物，包括营养细胞、细菌芽孢和孢子

消毒：用物理或化学方法杀死物料、容器、器皿内外的病源微生物。嗜热脂肪芽孢杆菌孢子死灭程度为N/N0=10-16时灭菌温度对维生素B1的影响灭菌温度(℃) 达到灭菌程度的时间(min) 维生素B1的损失(%)100 843 99.99110 75 89120 7.6 27130 0.851 10140 0.107 3150 0.015 1发酵工程实验中常用的消毒剂、浓度及使用范围1、在食品工业上的应用

（1）通过发酵工程使一些传统的发酵产品，如啤酒、果酒、食醋等，在产量和质量上得到明显的提高。

（2）通过发酵工程生产食品添加剂（见下表），改善了食品的品质及色、香、味。添加剂举例

酸味剂L-苹果酸、柠檬酸、乳酸鲜味剂肌苷酸、谷氨酸色素β-胡萝卜素、红曲素甜味剂高果糖浆、甜菜糖常用的几类食品添加剂第二节

发酵工程在食品工业上的应用（3）发酵工程有望为解决人类的粮食短缺问题开辟一条新的途径。

微生物含有丰富的蛋白质，如细菌的蛋白质含量占细胞干重的60%～80%，酵母菌的占45%～65%，而且它们的生长繁殖速度很快。因此，许多国家利用淀粉或纤维素的水解液、制糖工业的废液、石化产品等为原料，通过发酵获得大量的微生物菌体，这种生物菌体就叫做单细胞蛋白。20世纪80年代中期，全世界生产的单细胞蛋白已达2×106吨。用酵母菌等生产的单细胞蛋白可作为食品添加剂，甚至制成“人造肉”供人们直接食用。最近国外市场上出现的一种真菌蛋白食品，就以其高蛋白、低脂肪的特点受到了消费者的欢迎。单细胞蛋白用做饲料，能使家畜、家禽增重快，产奶或产蛋量显著提高。一、发酵法生产酒类饮料发酵工程在食品工业中的应用实例酒分白酒、黄酒、啤酒、葡萄酒。按颜色，分为有色酒和无色酒。按本质分，有压榨酒和蒸馏酒。压榨酒包括黄酒，啤酒，葡萄酒。压榨酒酒精含量比较低。

蒸馏酒主要指白酒。蒸馏酒的酒精含量高，浓度越高质量越高，高档的白酒酒精含量一般大于50℃。

浸米→蒸饭→淋饭→摊冷→加酒药（菌种）→发酵（缸中5-7d）→装坛→低温发酵→压榨→煮酒（灭菌）→装坛泥封→堆置陈化（后熟）→出厂

1、黄酒我国的民族特产和传统食品，也是世界上最古老的饮料酒之一。以谷物为主要原料，利用酒药、麦曲或米曲所含的多种微生物的共同作用酿制而成的发酵原酒。长江以南地区，主要分布在浙江、江苏、福建，以稻米为原料。长江以北地区，主要以小米为原料。制作过程按生产方法

按成品酒的含糖量黄酒的分类传统工艺黄酒新工艺黄酒干型黄酒

糖含量<1.00（以葡萄糖计，g/100ml）半干型黄酒

糖含量1.00-3.00半甜型黄酒

糖含量3.00-10.00

甜型黄酒

糖含量10.00-20.00

浓甜型黄酒

糖含量>20.00以纯种发酵取代自然发酵，以大型发酵生产代替小型手工操作，生产过程简化，原料利用率高，去除了笨重的体力劳动以酒药、麦曲或米曲、红曲及淋饭酒母为糖化发酵剂，进行自然的、多菌种的混合发酵生产而成，发酵周期长淋饭酒摊饭酒喂饭酒2、葡萄酒我国汉代（公元前138年），张骞出使西域带回葡萄，并引进酿酒艺人，开始有了葡萄酒葡萄酒分类按酒的颜色按含糖量按酿造方法按是否含有CO2红葡萄酒白葡萄酒桃红葡萄酒干葡萄酒半干葡萄酒半甜葡萄酒甜葡萄酒天然葡萄酒加强葡萄酒加香葡萄酒平静葡萄酒起泡葡萄酒葡萄汽酒用果皮带色的葡萄制成，酒色呈深红、鲜红、紫红或宝石红。用白葡萄或红皮白肉葡萄的果汁制成，酒色呈浅黄、禾秆黄、金黄色或近似无色。用带色红葡萄短时间浸提或分离发酵制成的，酒色呈桃红或浅玫瑰色。含糖量<4.0g/L含糖量4.1-12g/L含糖量12.1-50g/L含糖量>50.1g/L葡萄原料在发酵过程中不添加糖或酒精，即完全用葡萄汁发酵酿成的葡萄酒。人工添加白兰地或脱臭酒精，以提高酒精含量；或添加糖份提高含糖量。葡萄原酒浸泡芳香植物或药材制成的。不含CO2的葡萄酒CO2由葡萄酒加糖发酵产生或人工压入，酒中CO2含量在20℃时保持压力0.35MPa。CO2由葡萄酒加糖发酵产生或人工压入，酒中CO2在20℃时在0.051-0.25MPa。葡萄采下分选，厚皮的较好；去梗；表面消毒（KMnO4浸，无菌水淋洗，灭表面原菌）；发酵（温度20℃，2-3周，密闭或半密闭，皮厚的时间长些，皮薄的时间短些）；压榨：液体进行后发酵（20-25℃，一周），澄清，取上部液体，其中低挡的装瓶，较高档次的换桶（最好是橡木桶，橡木能产生抑菌物质，同时具有一种天然植物香）陈化三年（5℃）；渣进行蒸馏，调香，制成白兰地（酒精多）。主要工艺葡萄酒的再加工起泡葡萄酒：是一种含CO2的葡萄酒，以葡萄酒为基础，通过加糖发酵产生或人工压入CO2。香槟酒是起泡酒的一种起源于法国，因产于法国香槟地区而得名。目前世界各国都产起泡酒，并都将含一定CO2的优质白葡萄酒称为香槟酒。葡萄酒的再加工白兰地：是一种以水果为原料酿制而成的蒸馏酒，通常所说的白兰地是指以葡萄为原料生产的。原白兰地经橡木桶长期陈酿，调配匀兑，才能称为成品的白兰地。白兰地商标上的英文缩写：V.O（VeryOld）

V.O.P（VeryOldPale）

V.S.O.P（VerySuperiorOldPale）

X.O（ExtraOld）

很老极老最老超老酒龄（即贮陈期）规定不低于5年酒龄（即贮陈期）规定不低于10年大麦浸泡、发芽，烘干，去根，粉碎→加入粉碎的米中→糖化作用→加蛇麻（酒花，忽布花的雌花）→加酵母→低温发酵（12-15℃，3-5天；20-28℃，30-48h）→过滤→其中装瓶灭菌的为熟啤，不灭菌的为生啤.按颜色分为黄啤和黑啤，黄啤为淡啤，黑啤为浓啤。原料是大麦。按性质分为两类：生啤（散装）、扎啤、鲜啤、熟啤（瓶装）干啤

糖含量<4%大麦——主要原料，需制成麦芽后发酵。二棱大麦籽粒大而整齐，发芽均一，淀粉含量高，蛋白质含量较少，啤酒不易浑浊，过滤容易，为弥补淀粉不足，常用大米补充。蛇麻花——桑科葎草属，多年生缠绕茎植物。采用的是未受精的成熟雌花。是啤酒香味、苦味的来源；加速麦汁中高分子蛋白质的絮凝；提高啤酒起泡性和持泡性；可抑菌，增加麦汁和啤酒的生物稳定性。也可治牙疼，产于中国新疆、欧洲捷克。也称酒花、忽布花等。酶——α-淀粉酶，β-葡聚糖酶，β-淀粉酶，蛋白分解酶、半纤维素酶、支链淀粉酶。麦芽——水浸泡高于大麦10cm，10℃，63h；15℃，40h；30℃，38h。发芽，50℃烘12h，80℃烘3-5h，水分控制在23%。胚根长度不超过麦粒的二分之一，有57%-70%麦子出芽，即停止。（黑啤：100℃烘，连麦芽表面焦化，外黑内白，麦芽要除根。）原料大麦适于酿造啤酒的原因：大麦便于发芽，并产生大量的水解酶类；大麦种植遍及全球；大麦的化学成分适合酿造啤酒；大麦非人类食用主粮。麦芽汁的制备——麦芽粉碎，煮熟，糊化，保温30min，维持在50℃，取其二分之一再煮10min，加米粉，带送回糖化（65℃，30min），再取三分之一再煮10min，再送回糖化锅65℃，30min，过滤得麦芽汁，渣子可喂奶牛。加蛇麻花：100kg麦芽汁与1kg蛇麻混合

煮沸，冷却

。发酵前发酵：12-24h达高峰，T升到10℃，保持10-12天，过滤。后发酵：6-8周，T为0-2℃，密闭形成一定压力含CO2（0.45-0.5%），加木瓜蛋白酶，再过滤，过滤时加硅藻土（助滤剂）助滤，得生啤。灭菌30min，60-63℃，无沉淀，质量好，得熟啤。过程煮沸的目的：蒸发水分，浓缩麦汁；钝化全部酶和麦汁杀菌；蛋白质变性和絮凝；酒花有效组分的浸出；排除麦汁中特异的异杂臭气。啤酒制造工艺流程

使啤酒清凉爽口、散热解暑。因为泡沫是由于啤酒中充满二氧化碳而促发起来的。这些二氧化碳进入胃中后，遇热而膨胀又通过打嗝排出体外，从而带走体内部分热量，达到散热解暑的功效。

软化啤酒花的苦味和酒精的刺激性。泡沫还可以隔绝空气与酒液直接接触，从而减少了啤酒的氧化，有利于防止不良气味的产生。

泡沫可以保持啤酒的杀口力即二氧化碳与口腔粘膜和舌面接触后的麻辣感。这种口感是评定啤酒质量的重要指标之一。

将优质啤酒倒入杯中时，泡沫能从杯中升起，可持续五分钟以上，且细腻、洁白、挂壁、泡沫的持久性与细腻，持久，口味醇厚。啤酒的质量也就好。

气泡的稳定程度与液体的表面张力有关，而张力又与温度有关。据实验，啤酒的泡沫以10°C-12°C时最多，且持久，口感也最佳。

啤酒中泡沫的作用降低成本，加30%大米，提高淀粉含量。大麦发酵在红搅拌通气，缩短发芽时间，提高发芽率。添加赤霉素，促进发芽。发酵时密封，提高温度，缩短发酵时间。采用固定化技术，用海藻酸钠，把酵母菌固定到海藻酸钠上，反复利用，省去过滤，发酵周期12-14天。青岛啤酒透明，麦芽香，CO2丰富，浓郁，3.5%酒精含量，泡沫细白、挂杯持久。风味啤酒加中药（生姜、香草、桂皮、杜仲）新工艺根据菌种制剂分大曲酒、小曲酒。大曲：砖形、大，主要用小麦、豌豆作培养基，菌种为曲霉。大曲用料多，需粉碎。优点是便于存放。大曲酒发酵时间长，产品质量好，但成本较高，出酒率偏低，全国名白酒、优质白酒和地方名酒的生产，绝大多数用大曲作糖化发酵剂。小曲：不定形、小，主要用大米、米、糠、中草药作培养基，菌种为根霉，毛霉，可以是固体也可是液体，接种时用量少。4、白酒饮料酒生产如啤酒和葡萄酒等酿造酒，一般都是采用液态发酵，而我国白酒采用固态酒醅发酵和固态蒸馏传统操作，是世界上独特的酿酒工艺。酒曲的主要种类（1）大曲:

大曲是固态发酵法酿造大曲白酒的糖化剂。以小麦或大麦、豌豆为曲料，经过粉碎、加水拌料、踩曲制坯、堆积培养，依靠自然界带入的各种酿酒微生物（包括细菌、霉菌和酵母菌）在其中生长繁殖制成成曲，再经贮存后制成陈曲。大曲有高温曲（制曲温度60℃以上）和中温曲（制曲温度不超过50℃）两种类型。目前国内绝大多数著名的大曲白酒均采用高温曲生产，如茅台、泸州、西风、五粮液等。（2）麸曲:

麸曲是固态发酵法酿造麸曲白酒的糖化剂。以麸皮为主要曲料，以新鲜酒糟为配料，经过润水、蒸煮、冷却后，接种黑曲霉和黄曲霉混和（比例为7：3），再经通风培养制成成曲。（3）小曲（米曲）:半固态发酵法酿造小曲白酒（米酒）的糖化发酵剂。以米