食品毒理学 外源化学物的致癌作用学习课件

PAGEPAGE12第九章外源化学物的致癌作用肿瘤毒理学的一部分。肿瘤在死因排位中稳居前三位已逾40年,与此同时,死亡人数逐年攀升。（2007年出版）肿瘤尤其是恶性肿瘤是危害健康和生命的常见病之一，调查研究的结果显示，在死因排位上，恶性肿瘤死亡占城市居民死亡原因之首，在农村居民中位居第三。在死亡者的比例上每５个死亡者中有１个死于恶性肿瘤。2012年，全国肿瘤登记中心收到全国104个肿瘤登记处2009年肿瘤登记数据。通过对上报数据的综合审核，有72个登记处的数据入选，以反映2009年我国肿瘤登记覆盖地区恶性肿瘤的发病与死亡水平。入选资料覆盖人口达8547万，包括了31个城市地区（5749万人）和41个农村地区（2789万人），登记结果令人震惊。全国登记地区发病率（粗率）285.91/10万，中国人口标化率为146.87/10万，累计率（0～74岁）为22.08%。全国登记地区恶性肿瘤死亡率（粗率）为180.54/10万，中国人口标化率为85.06/10万，累计率（0～74岁）为我国居民因癌死亡的几率为12.94%。这让也就意味着，约每5个人中就可能有一个人会罹患癌症，约每8个人中就可能有一个人会死于癌症！恶性肿瘤发病恶性肿瘤发病前十位主要是肺癌、消化系统癌（胃癌、结直肠癌、肝癌、食管癌、胰腺癌）、乳腺癌、淋巴瘤、膀胱癌、甲状腺癌。这十类肿瘤占全部恶性肿瘤发病的76.39%。第一节化学致癌物质一、人类化学致癌物附录：IARC关于化学物质致人类癌症危险性分类只与一种化学物致癌性证据的充分性(证据权重)有关，而并不涉及其致癌活性大小及其机制。IARC将化学物对人类致癌性资料(流行病学调查和病例报告)和对实验动物致癌性资料分为四级：致癌性证据充分、致癌性证据有限、致癌性证据不足及证据提示缺乏致癌性。对人致癌性证据充分是指在致癌物和人癌症发生之间有因果关系。致癌性证据有限是指因果关系的解释是可信的，但其他的解释如偶然性、偏倚、混杂因素不能完全排除。致癌性证据不足是指资料的性质、一致性或统计学把握度不足以判断因果关系或没有对人致癌性的资料。证据提示缺乏致癌性是指有几个在已知人类充分暴露水平范围内的研究表明暴露水平与所研究的癌症无关联。分类为人致癌物(组1)必须要有流行病学证据的支持。流行病学研究(队列研究和病例对照研究)试图为化学品接触与人群癌症发生(或死亡)增加的因果关系提供证据。癌症流行病学研究是比较困难的，一般是在人群接触某种化学品多年之后进行，可能有很多混杂因素，并往往受到经费和时间的限制。为治疗目的给以化学品(药品)和职业性接触，较易控制接触条件，但个体数和接触期限也往往受到限制。因此，对于很多化学品需要由动物致癌试验、短期试验等为接触此化学品的致癌危险性提供论据(主要用于危害鉴定)。化学致癌物为凡能引起动物和人类肿瘤、增加其发病率或死亡率的化合物，比如黄曲霉毒素、3,4一苯并（a）芘及苯等。化学致癌作用是化学致癌物在人体内引起肿瘤的过程。到20世纪90年代中期为止，国际癌症研究中心（IARC)2002年共评述了878种化学物质。根据证据的强度将已评述的化学物质分为四组：(1)Ⅰ组对人类确是致癌物，是指在人类流行病学及动物致癌实验中均有充分证据的致癌物，有87种；(2)II组对人类是很可能或可能是致癌物。又分为两组，II组2A和II组2B。①Ⅱ组2A：对人类很可能是致癌物，是指对人类致癌性证据有限，对试验动物致癌性证据充足，有63种；②Ⅱ组2B：对人类是可能致癌物，是指对人类致癌性证据有限，对试验动物致癌性证据并不充分，或是指对人类致癌性证据不足，对试验动物致癌性证据充分，有234种；(3)Ⅲ组可疑致癌物，现有的证据不能对人类致癌性进行分类，有493种；(4)Ⅳ组非致癌物，对人类可能是无致癌作用，有1种。IARC已确定的人类致癌物或生产方式及其靶器官见表9一1。根据化学致癌物对细胞成分作用及引起癌症发生的机制不同可分为遗传毒性致癌物和非遗传毒性致癌物。(1)遗传毒性致癌物化学致癌物或其代谢物与DNA共价结合，引起基因突变或染色体结构和数量的改变导致癌变，称为遗传毒性致癌物。这类致癌物占化学致癌物的大多数，因其作用机制是损伤遗传物质，可利用遗传毒理学试验来检测该类致癌物。①直接致癌物：本身直接具有致癌作用，在体内不需要经过代谢活化即可致癌。例如，各种烷化剂，大多数为亲电子反应物。这类物质绝大多数是合成的有机物。包括有内酯类如β-丙烯内酯等；烯化环氧化物如1，2，3，4-丁二烯环氧化物；亚胺类；硫酸酯类；芥子气和氮芥；活性卤代烃类等等。

②间接致癌物：本身并不直接致癌，必须在体内经代谢活化，其所形成的代谢产物才具致癌作用。例如，多环芳烃、芳香胺类化合物等。前致癌物分为天然和人工合成两大类。人工合成的主要有：多环或杂环芳烃类如苯并（a）芘、3-甲基胆蒽等；单环芳香胺类如邻甲苯胺等；双环或多环芳香胺类如联苯胺等；喹啉类；硝基呋喃类；硝基杂环类；烷基肼类等等。天然物质主要有黄曲霉毒素、环孢素A、烟草和烟气、槟榔及酒精性饮料。

③无机致癌物：有些可能是亲电子剂，但有些是通过选择性改变DNA复制保真性，导致DNA的改变，如金属镍、铬。铀、镭、氡等可能由于其放射性致癌。镍、铬、钛、锰等金属及其盐类可在一定条件下致癌。

在无机致癌物中，有些能损伤DNA，但有些可能通过改变DNA聚合酶而致癌。(2）非遗传毒性致癌物化学致癌物或其代谢物不直接作用遗传物质，而作用于遗传物质以外的生物大分子，称为非遗传毒性致癌物。①促长剂：本身无致癌性，在给以遗传毒性致癌物之后再给以促长剂可增强遗传毒性致癌物的致癌作用，也可促进“自发性”转化细胞发展成癌。例如，佛波脂（TPA及其衍生物）、苯巴比妥、二丁基羟基甲苯（BHT）、1,8,9一蒽三醇、DDT，ALkanes及胆盐等。如TPA是小鼠皮肤癌诱发试验的促癌剂；苯巴比妥对大鼠肝癌有促癌作用；色氨酸和糖精对膀胱癌有促癌作用；丁基羟甲苯、DDT、多卤联苯、氯丹、七氯和四氯二苯并对二恶英（TCDD）等。②内分泌调控剂：主要改变内分泌系统平衡及细胞正常分化，常起促长剂作用。例如乙烯雌酚、雌二醇、硫脲等。如孕妇使用雌性激素（已烯雌酚）保胎可能使其女儿在青春期发生阴道透明细胞癌。有些物质不是激素，但干扰内分泌系统而致癌，如3-氨基三唑诱发大鼠甲状腺肿瘤与干扰甲状腺素合成有关。③免疫抑制剂：主要对病毒诱导的恶性转化起增强作用。例如，嘌呤同型物。如硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤等免疫抑制剂或免疫血清均能使动物和人发生白血病或淋巴瘤，但很少发生实体肿瘤。④细胞毒剂：可能引起细胞死亡，导致细胞增殖活跃及癌发展。例如，次氮基三乙酸及氯仿等。次氮基三乙酸使锌进入肾脏，由于锌的毒性，造成细胞死亡，结果引起增生和肾肿瘤。⑤过氧化物酶体增殖剂：过氧化物酶体增殖可导致细胞内氧自由基过量生成。例如，祛脂乙酯、邻苯二甲酸乙基己酯。能使啮齿动物肝脏中的过氧化物酶体增生的各种物质都可诱发肝肿瘤。如降血脂药安妥明、降脂异丙酯、增塑剂二-苯二甲酸酯和有机溶剂1，1，2-三氯乙烯。

⑥固体物质：物理状态是关键性因素，可能涉及细胞毒性。例如，塑料、石棉等。动物皮下包埋塑料后，经过较长的潜伏期，可导致肉瘤形成。石棉在人和动物的胸膜表面可引起胸膜间皮瘤。石棉和其他矿物粉尘，如铀矿或赤铁矿粉尘，可增强吸烟致肺癌的作用。二、化学致癌物的代谢活化与灭活致癌物通过不同途径进入人体后，有些可直接与靶分子起作用，有些需经过Ⅰ、Ⅱ相代谢，所产生的代谢产物才有致癌活性（代谢活化）。各种有活性的致癌物再经历不同的代谢过程成为致癌性减弱、极性增高的产物排出体外（代谢灭活）。不同致癌物的代谢活化与代谢灭活的过程不一，但都受一系列I、II相酶所催化，代谢酶活性强弱直接左右代谢过程的强弱程度，最终影响到达靶子的有效剂量，此剂量被称为生物有效剂量，它是体内剂量中与致癌物作用强弱关系最为直接的剂量。不同组织中不同类型代谢酶的分布有明显差异，这种分布的特点直接影响致癌物作用靶子的特异性。三、化学致癌物作用的靶子化学致癌物本身或它的活性代谢产物在体内诱发肿瘤必先作用于有关靶子。就目前所知的这类靶子可分为两大类：DNA靶子与非DNA靶子。(1)DNA靶子由于各种与肿瘤发生和发展的基因都排列在DNA链上，各种类型的致癌物都可与DNA作用，产生碱基损伤、链断裂、链交联等不同形式的损伤。这在多种体内、体外模型的观察中都得到了充分的证实。但问题是这些损伤与肿瘤的发生是否有关？就目前所得观察结果来看，回答是肯定的。人体内细胞数共约为1014个，每个细胞内的DNA每日可能出现的损伤数可达4000个之多。严重损伤可致细胞死亡，未致死亡的损伤可经历修复过程，少部分可能出现突变。突变的结局是多方面的，其中部分可发展成恶性转化。因此，权衡DNA损伤与致癌关系时，这些因素需加以充分考虑。一般认为致癌物诱导生成DNA加合物的数量与致癌性有密切关系。DNA上的前癌基因很可能是化学致癌物的靶子。抑癌基因同样可能是致癌物的主要靶子。以p53为例，突变主要在第5～8外显子的保守区域，G一C碱基对出现转换引起错义突变。这类突变主要见于多种人类肿瘤，亦见于实验用啮齿类动物的同类肿瘤。(2）非DNA靶子主要有两类：一是作用于纺锤丝系统，另一个是作用于与DNA修复或基因表达调控有关的酶系统。作用于纺锤丝的化学物质本身不直接作用于遗传物质，传统上认为它不是诱变剂，但实际上具有诱变作用。第二节化学致癌过程动物或人的正常细胞如何在化学致癌物的作用下，逐步转化成恶性癌细胞？在体内如何逐步发展成可见肿瘤，并转移到机体其它部分组织？有哪些因素参与？通过哪些机制获得不同阶段的发展？这过程一旦开始是否有可能加以阻止或使之逆转？癌变早期可能出现哪些可以加以识别和利用的特异性标记？这些都是需要解决的问题。一、化学致癌作用——一个多因素、多基因参与的多阶段过程肿瘤的形成与发展需要有原癌基因的激活与肿瘤抑制癌基因的灭活，二者同时存在。一些细胞生长因子、生长信号传递系统等一系列与生命重要功能有密切关系的基因出现突变，才使肿瘤细胞得以形成和发展。近年对于多基因、多因素参与人类致癌过程问题，大致有以下几个方面认识：（1）致癌过程有多个与癌肿有关的基因参与。就目前所知有关的基因可分为四类：第一类是前癌基因，包括生长与增殖基因、各种转录因子或信号传递功能的基因；第二类是肿瘤抑制基因；第三类是程序性死亡有关的基因；第四类是新近发现的如肿瘤易感基因，见于乳腺癌患者家属。这几类基因是相互作用的。增加细胞的生长与增殖固然可能是肿瘤形成的途径，减少细胞死亡亦可造成细胞的过度扩增。在50多种前癌基因中，研究得最深入的是ras基因族。它在多种人类肿瘤或化学致癌物诱导的动物肿瘤均见出现活化。主要活化型或是在第12、13、16、117与146密码出现点突变。（2）不同器官来源、不同组织类型、临床阶段以至同一种肿瘤在不同地区所见的遗传变化是不同的。例如K-ras突变常见于胰腺癌、结肠癌，但是乳腺癌及肝癌则少见。胃的肠型腺癌见c一erbB一2扩增，但在硬化型则见不到这种变化。K-ras癌基因（编码酪氨酸激酶受体）在硬化型胃腺癌、图章戒指型胃癌出现扩增，而在肠型腺癌则不见有。在50%食管癌与15%乳腺癌见HSTI与INT2基因扩增。在胃癌从未见有。同属肝癌在AFB1高度污染区与低度污染区所见p53基因突变类型不一。（3)多种环境致癌物、致癌因子或条件可协同作用。人类接触致癌物、致癌因子或条件都不可能是单一的。例如，接受环境致癌物的同时会接受到内源性致癌因素的作用。又如体内氧化过程产生的各种活性氧可导致DNA损伤并引起突变。这些遗传改变亦可能参与致癌过程。感染亦在某些肿瘤发展中起着重要作用。以肝炎C型病毒（HCV）感染为例，它一方面使肝细胞死亡，继而使之出现代偿性再生。肝细胞通过多次细胞分裂，可使已有遗传改变逐渐积累扩大，同时形成局部老化。正常成人肝细胞很少分裂，可能最多是一年一次。若HCV感染后出现30次分裂，这就意味着比正常人老化速度快30倍。(4）个体的不同遗传背景对肿瘤的发生发展有重要影响。高癌家族现象已为人所熟知。近年对于着色性干皮病（XP）、家族性多发性肠道息肉、Wilm瘤以及视网膜母细胞瘤的遗传学及有关基因已基本弄清楚。DNA正确修复能力与突变发生有直接关系，而DNA修复能力缺陷者往往对肿瘤有易感倾向。因此，多种DNA修复缺陷与肿瘤敏感性关系已越来越受到重视。二、细胞增殖与致癌作用细胞增殖（CP）可通过多种途径影响致癌过程。从启动、促癌、发展以及转移各个过程，往往都有CP参与。启动过程导致启动细胞的出现。正常细胞DNA受损经错误修复出现突变需要通过固定过程才能形成启动细胞。细胞必须经过DNA合成、细胞分裂才可能出现各种形式基因突变、染色体畸变或基因扩增，可见细胞增殖是一个影响致癌过程的重要因素。若细胞暂时停止进入细胞分裂周期，细胞DNA就会有较充分的时间进行修复，突变就可能不出现。即使有启动细胞出现，没有CP，启动细胞的数目亦不会增加。肿瘤也可看作是一种机会性疾病。受损细胞的数目越多，得到下次遗传性损害的机会亦越大，发展成可见肿瘤的机会亦越大。促癌阶段中CP的作用更为明显。三、细胞程序性死亡与致癌过程致癌过程与细胞的生与死都有密切关系。大量无控制的细胞增殖固然是致癌过程不可缺少的条件，而细胞死亡调控的失调亦是导致肿瘤形成的一个重要（甚至可以说是必要）的条件。因此有学者提出：细胞恶性转化是由于细胞增殖与细胞死亡调控功能失调所致。细胞死亡与细胞增殖过程一样，涉及到一个相当复杂的调控过程。细胞程序性死亡（PCD）的触发是一个系列基因（有人认为至少有14个基因参与）表达的结果，它广泛存在于正常组织的不同形态发生、生长与发育阶段。PCD所诱发的细胞与坏死性细胞死亡在形态上、生长改变上都有明显差别，可见这是一种特殊的主动形式，因此称为凋亡，如同秋天落叶，生死规律的交替，使生命得以正常的延续。机体对于致癌物所引起的DNA损伤除了动员修复机制进行修复以外，亦会启动自身清除机制，例如PCD清除突变或癌变细胞。在外源性或内源性因素作用下，体内细胞的突变频率应当是相当高的（相当于每个基因和细胞10-9～10-5次，再乘以每日细胞分裂数，约为109细胞/d），若无适当的清除机制，突变频率将十分高，据此推算肿瘤发生率应比现在高得多，但事实并非如此。PCD可能是清除这类突变细胞或癌变细胞的途径之一。启动细胞要发展成可见肿瘤必须改变自身对于PCD的反应，以便能逃脱这种清除。任何一种机制若能使经致癌物损伤的细胞更多地存活下来，都有会增加致癌的危险性，因为这种存活意味着有更多的机会积累必要的多次遗传损伤，使之获得肿瘤表型。四、DNA修复与致癌过程外源性或内源性因素对于人体内DNA损伤的方式是多种多样的。可出现单个或多个碱基损伤，亦可出现链断裂或链交联。机体对此相应发展了多种形式的修复方式。目的是将受损部分去掉，再补上被除去部分的空缺。这部分成分若是完整无缺的或功能上是完全相同的，就是正确修复，机体内这部分DNA完全回复原有的结构或功能。但在一定条件下，经修补的部分结构或功能上可能是有缺陷的。这就出现易错修复。通过错误修复，细胞尽管仍然能够生存并保持了部分功能，但代价是出现突变。从这一角度来看，有些修复过程，它本身也是一个诱变过程，修复与突变的关系是密不可分的，甚至可以说：没有修复就没有突变。化学突变不是通过损伤－突变这样一种模式，而是损伤－修复－突变模式形成的。DNA损伤的后果是什么？在很大程度上是受机体对DNA损伤方式与修复能力所左右。受到致癌物的作用后是否会出现癌基因活化，抑癌基因失活等一系列致癌过程，在一定程度上亦受制于DNA修复。五、某些非遗传机制与致癌过程传统上将致癌过程中致癌因素对于DNA所引起的一系列启动作用列为遗传机制，而对于DNA以外靶子所起的作用称为非遗传或非遗传毒性机制。这类机制，涉及的因素很多，目前研究得比较充分的主要有：细胞间隙连接通讯（GJIC)；信号传导系统，其中特别是蛋白激酶C(PKC）作用；激素作用等方面的因素。它们在不同方面不同程度上参与了多阶段的致癌过程。对于某些致癌因素来说，这些非遗传机制对于它们所诱导的致癌过程起着关键的作用，是不容忽视的方面。附录：对化学致癌作用的机制研究已有多年的历史，并形成了一些学派，主要有遗传机制学派(genetictheory)和遗传外机制学派(epigenetictheory)。遗传机制学派认为，外来致癌因素引起细胞基因的改变或外来基因整合到细胞基因中，从而导致癌变。遗传外机制学派认为癌症的发生是由于非基因改变机制引起的。随着分子生物学、生物化学及遗传学等基础学科的迅速发展，目前对致癌作用机制的认识逐步深入，鉴于致癌物的多样性和致癌过程的复杂性，遗传机制和遗传外机制可能是相辅相成的，在致癌作用的不同阶段中起作用。化学致癌机制重要的学说有亲电子剂学说、体细胞突变学说、癌基因学说和癌变的阶段学说。目前认为，正常细胞经过遗传学改变的积累，才能转变为癌细胞，癌症的发生是多阶段过程，至少包括引发、促长和进展阶段。癌变的阶段学说是在上世纪40年代，Rous、Mottram和Bemblum等分别研究利用致癌性多环芳烃和巴豆油诱发小鼠皮肤乳头瘤，提出化学致癌的两阶段学说，即引发(启动，initiation)和促长(promotion)两个阶段。其实验证据是用亚致癌剂量(即在实验期间不引起肿瘤发生的剂量)的致癌性多环芳烃涂抹小鼠皮肤一次，20周后不发生乳头瘤或很少发生。但如在使用剂量相同的致癌物之后再用巴豆油涂抹同一部位(每周2次，共20周)则有约1／3～1／2的小鼠发生乳头瘤。单独使用巴豆油或在涂抹致癌物之前使用巴豆油都不引起乳头瘤。据此提出化学致癌的引发和促长两阶段学说，将所用的致癌性多环芳烃称为引发剂(initiator)，巴豆油称为促长剂(promotor)，巴豆油中具有促长作用的有效成分经鉴定为佛波醇酯(TPA)。癌变的阶段学说在肝、膀胱、肺、胃肠道等癌症发生和体外细胞转化试验中得到证实。进一步的研究证明，癌变过程是多阶段过程，从良性肿瘤向恶性转变的过程称为进展(progression)阶段。化学致癌过程的主要阶段见图9-2，在引发和进展阶段有细胞基因组(DNA)的结构改变。在促长阶段虽不涉及细胞基因组的结构改变，但依赖于基因的表达改变。前致癌物正常细胞DNA结合活化修复引发的细胞DNA结合终致癌物致癌物-DNA促长加合物分化的肿瘤DNA复制进展错配修复失败DNA修复不分化的癌转移细胞死亡细胞含错配碱基图9-2化学致癌过程的主要阶段一、引发阶段引发阶段是指化学物或其活性代谢物(亲电子剂)与DNA作用，导致体细胞突变成引发细胞的阶段。在引发过程中至少有三个细胞功能是重要的，即致癌物的代谢，DNA修复和细胞增殖。Miller等(1971)提出亲电子剂学说，认为大多数有机致癌物都是间接致癌物，又称前致癌物，或先形成近致癌物再进一步活化成终致癌物。终致癌物是亲电子剂，含有亲电子中心，可与细胞大分子的亲核中心共价结合，进而导致癌症。本身就有反应活性，不需要代谢活化的致癌物或能自发形成亲电子剂的致癌物称为直接致癌物。毒物代谢酶类对于间接致癌物具有代谢活化和代谢解毒双重功能，间接致癌物的致癌性取决于代谢活化和代谢解毒之间的平衡。终致癌物引起DNA损伤可诱导DNA修复，DNA修复可能是无误的，也可能将错误的碱基引入基因组，而细胞增殖对于产生基因组可遗传的改变是必需的。引发阶段历时很短，引发作为一个突变事件，需要一次或多次细胞分裂来“固定”引发事件，引发所确定的基因型和／或表型是不可逆的。引发细胞在形态上与正常细胞很难区别。引发是不可逆的，但并非所有的引发细胞都将构成肿瘤，因其中大多数将经历程序性细胞死亡(凋亡)。引发细胞不具有生长自主性，因此不是肿瘤细胞。引发剂本身有致癌性，大多数是致突变物，没有可检测的阈剂量，引发作用是不可逆的并且是累积性的。引发剂作用的靶主要是原癌基因和肿瘤抑制基因。引发阶段的个体变异、物种差异及亲器官特征是取决于细胞对致癌物的代谢、DNA修复及细胞增殖／凋亡的平衡。二、促长阶段促长阶段是引发细胞增殖成为癌前病变或良性肿瘤的过程。促长剂单独使用不具致癌性，必须在引发剂后使用才发挥促长作用，促长剂通常是非致突变物，存在阈剂量和最大效应，其剂量反应关系呈S形曲线。促长剂通常影响引发细胞的增殖，导致局部增殖并引起良性局灶性病理损害如乳头瘤、结节或息肉。这些病损很多会消退，仅少数细胞发生进一步突变引成恶性肿瘤。促长剂可能经特异的受体中介干扰细胞信号转导途径、改变基因表达；促长剂可能在细胞和分子水平上通过改变细胞周期控制，选择性促进引发细胞的增殖；促长剂还可能抑制程序性细胞死亡(凋亡)。促长阶段历时较长，早期有可逆性，晚期为不可逆的，因此在促长阶段(特别是在早期)持续给以促长剂是必需的。促长阶段的另一个特点是对生理因素调节的敏感性，衰老、饮食和激素可影响促长作用。证实引发和促长作用的实验方案如图9-3A，实验期限一般为3-6个月，终点一般是癌前损害(PNL)，如小鼠皮肤乳头瘤、大鼠和小鼠肝转化灶、大鼠乳腺末端芽状增生、大肠和结肠的变性隐窝等。三、进展阶段进展阶段是从引发细胞群(癌前病变、良性肿瘤)转变成恶性肿瘤的过程，在进展期肿瘤获得生长、侵袭和转移。在进展期中可观察到恶性肿瘤(癌)的多种特征，包括生长率增加、侵袭、转移、对激素无反应性、形态特征随疾病的发展独立地变异等。这些特征是由于在进展阶段的核型不稳定性。环境因素在早期可影响进展阶段，但随恶性肿瘤的生长和核型不稳定性的发展，对环境因素的反应可能丧失。作用于促长阶段的细胞转变成进展期的化学物称为进展剂(progressor)，进展剂可引起染色体畸变，但不一定具有引发活性。进展剂导致核型不稳定性的机制很多，包括有丝分裂装置的紊乱、端粒功能改变、DNA低甲基化、重组、基因易位和基因扩增等。进展阶段主要的特征是核型不稳定性，肿瘤的染色体发生断裂和断片易位，存在多复本或部分／整个缺失。染色体结构改变伴有细胞癌基因和／或肿瘤抑制基因的突变，这些突变可能反映了适于恶性生长的细胞选择并也可能反过来增加了核型不稳定性。这些突变可能来自于癌基因／肿瘤抑制基因的功能改变或由于化学致癌物暴露。表9-3多阶段致癌的形态学和生物学特征引发促长进展1.不可逆性1.在基因表达和细胞水平上有可逆性1.不可逆性2.经引发的“干细胞”在形态学上不能鉴定2.持续给以促长剂才可维持促长细胞群2.核型不稳定性导致细胞基因组结构的形态学改变；3.对外源化学物及其他化学因子敏感；3.对衰老、饮食和激素因子敏感3.在进展阶段早期，已改变的细胞对环境因子敏感；4.引发细胞可能自发(内源性)发生；4.内源性促长剂可起“自发性”促长作用；4.在进展阶段观察到良性或恶性能肿瘤5.需经细胞分裂“固定”；5.剂量—反应关系显示有阈值和最大作用；5.进展剂使已促长的细胞进入此期。6.剂量—反应关系没有易于确定的阈值；6.以能否有效地扩大引发细胞群来确定促长剂的相对强度。7.经规定的促长阶段后，定量癌前病变来确定引发剂的相对强度。证实进展作用的实验方案比较复杂(图9-3B)，是在引发和促长阶段之后再给以进展剂，然后再继续给以促长剂，实验应有适当的对照，终点为恶性损害(NL)。引发、促长和进展阶段的形态学和生物学特征见表9-3。兼有引发剂、促长剂和进展剂作用的化学致癌物可称为完全致癌物(completecarcinogen)。综上所述，化学致癌是长期的、复杂的多阶段过程，至少涉及引发、促长和进展三个阶段。在引发和进展阶段涉及遗传机制，在促长阶段主要是遗传外机制。在引发阶段主要是细胞原癌基因和肿瘤抑制基因的突变，在进展阶段主要是核型不稳定性。正常细胞经过遗传学改变的积累才能转变为癌细胞。第三节化学毒物致癌性的判别目前所使用的系统大致可分为三大类：短期试验、动物诱癌试验和人类流行病学观察。它们在判别化学物质致癌性方面各有其长短处，往往需要互为补充才能作出可靠的结论。哺乳动物致癌试验哺乳动物致癌试验是鉴定化学致癌物的标准体内试验。哺乳动物致癌试验用来确定受试物对试验动物的致癌性、剂量—反应关系及诱发肿瘤的靶器官。在下列情况下，一般应考虑进行致癌性评价：①人体可能长期暴露于该化学物；②该化学物或其代谢物的化学结构与已知致癌物相似；③反复染毒毒性试验提示该化学物可能产生癌前病变。此外，研究结果表明，如在3种遗传毒理学短期试验均得到阳性结果，可预测为遗传毒性致癌物；如在3种遗传毒理学短期试验均得到阴性结果，可预测为非遗传毒性非致癌物；如经5种遗传毒理学短期试验仍不能预测其致癌性的化学品，应优先进行哺乳动物致癌试验。一、试验动物物种和品系：要求用两种实验动物，常规选用大鼠和小鼠，也可用仓鼠。啮齿类动物对多数致癌物易感性较高，寿命相对较短，费用也较低，生理和病理资料较完备，因此使用最广泛。在选择品系时应选择较敏感、自发肿瘤率低、生活力强及寿命较长的品系。性别：为接近人类情况，应使用同等数量的雌雄两种性别的动物。年龄：使用刚离乳的动物，以保证有足够长的染毒和发生癌症的时间，而且幼年动物解毒酶及免疫系统尚未完善，对致癌作用比较敏感。二、剂量选择和动物数量致癌试验一般设三个试验组。美国NCI推荐以最大耐受剂量(MTD)为高剂量。最大耐受剂量是由90天毒性试验来确定的，此剂量应使动物体重减轻不超过对照组的10％，并且不引起死亡及导致缩短寿命的中毒症状或病理损伤（最大可行剂量，受试物在饲料中最高含量为5％。限制剂量为1500mg／(kg体重·d)）。中及低剂量组则按等比级数下推，如分别为上一个剂量水平的1／2或1／3。低剂量组应不影响动物的正常生长、发育和寿命，即不产生任何毒性效应。但低剂量组应高于人的接触剂量，一般不低于高剂量的10％。中剂量组介于高、低剂量之间，如有可能按受试物的毒物动力学性质来确定。对照组除不给受试物外，其他条件均与试验组相同。同时应设阴性(溶剂或赋形剂)对照组。必要时可设阳性对照组，阳性致癌物最好与受试物的化学结构相近。试验动物数与试验组动物肿瘤发生率、对照动物肿瘤自发率及要求的统计学显著性水平有关。三、染毒途径应尽可能模拟人体可能的暴露途径，主要途径有经口、经皮和吸入三种，应根据受试物的理化性质和接触方式选择确定。经口染毒是将受试物给予实验动物的常用途径，一般把受试物掺入饲料或饮水中连续给予动物(5～7天／周)。若掺入后的适口性不良，可用灌胃法。掺入浓度要定期监测，观察其均匀性和稳定性，掺入的浓度一般不超过5％。经皮染毒，涂敷受试物的面积一般不少于动物体表总面积的10％。必须保证受试物与皮肤良好接触，并防止动物舔食。每天涂抹一次，每周3～7次。吸人染毒，每天染毒4小时，每周5～7天。染毒柜内受试物浓度应定期或连续监测，其分布应均匀、恒定。其他注射途径可根据需要采用。四、试验期限ICH(1997)建议参考下面几条准则：(1)一般情况下，试验期限小鼠和仓鼠应为18个月，大鼠为24个月；然而对于某些生命期较长或自发肿瘤率低的动物品系，小鼠和仓鼠可持续24个月，大鼠可持续30个月。(2)当最低剂量组或对照组存活的动物只有25％时，也可以结束试验，对于有明显性别差异的试验，则试验结束的时间对不同的性别应有所不同，在某种情况下因明显的毒性作用，只造成高剂量组动物过早死亡，此时不应结束试验。一个合格的阴性对照试验应符合下列标准：①因自溶、同类自食，或因管理问题所造成的动物损失在任何一组都不能高于10％。②小鼠和仓鼠在18个月，大鼠在24个月时各组存活的动物不能少于50％。五、观察和结果分析1.一般观察每天观察受试动物一次，主要观察其外表、活动、摄食情况等。在实验最初三个月每周称体重一次，以后每两周称体重一次。经饲料或饮水给以受试物时，应记录食物消耗量或饮水量，以计算受试物的摄人量。观察时要注意有无肿瘤出现、肿瘤出现时间及死亡时间。老年动物多病易死，应加强巡视，防止动物死亡后未及时剖验，发生尸体组织自溶。2.病理检查动物自然死亡或处死后必须及时进行病理检查，包括肉眼和组织切片检查。组织切片检查应包括已出现肿瘤或可疑肿瘤的器官和肉眼检查有明显病变的器官，应注意观察癌前病变。通过病理检查确定肿瘤的性质和靶器官。3.结果分析统计各种肿瘤的数量(包括良性和恶性肿瘤)及任何少见的肿瘤的动物数、每只动物的肿瘤数及肿瘤潜伏期。肿瘤发生率(％)=(实验结束时患肿瘤动物总数／有效动物总数)×100％式中，有效动物总数指最早发现肿瘤时存活动物总数。肿瘤潜伏期即从摄人受试物起到发现肿瘤的时间，因为内脏肿瘤不易觉察，通常将肿瘤引起该动物死亡的时间定为发生肿瘤的时间。应对试验结果进行仔细的统计学分析，并研究剂量—反应关系。致癌试验阳性的判定标准为WHO提出的标准。WHO(1969)提出机体可以对致癌物有下列一种或多种反应：(1)对于对照组也出现的一种或数种肿瘤，试验组肿瘤发生率增加；(2)试验组发生对照组没有的肿瘤类型；(3)试验组肿瘤发生早于对照组；(4)与对照组比较，试验组每个动物的平均肿瘤数增加。在进行试验的两个物种两种性别动物中，有一种结果为阳性，即认为该受试物有致癌性。两个物种两种性别动物试验结果均为阴性时，方能认为未观察到致癌作用。在结果报告中，应着重报告发现肿瘤的部位、数量、性质、癌前病变，以及其他毒性效应；应报告剂量—反应关系及统计学分析结果。如在动物组织中观察到良性和恶性肿瘤，并有良性肿瘤向恶性化进展的证据，在进行统计学分析之前将良性和恶性肿瘤合并是适宜的，但仍希望分别对良性和恶性肿瘤分别进行统计学处理。评价该试验不同剂量良性肿瘤和恶性肿瘤的相对数量可有助于确定该受试动物对受试物的剂量反应关系。另一方面，如果仅观察到良性肿瘤，并无恶性化进展的证据，则将此受试物认为是致癌物是不适宜的，此仅提示在该试验条件下需要进一步研究。与研究致癌作用有关的其他试验一、短期试验哺乳动物致癌试验是标准体内试验，对于鉴定哺乳动物致癌物是关键性的试验，但其实验条件要求较高，人力、经费及时间耗费巨大，难以满足化学品安全性评价的要求。为此，发展了一些与研究致癌作用有关的其他试验。一、用于致癌物筛选的短期试验目前已建立的短期试验为数近百种。在发展这些方法的早期，由于对于致癌过程的复杂性认识还不充分，有些学者认为诱变性与致癌性关系密切，单纯利用短期的诱变试验就可以预测致癌性（Ames，1973）。但经过大量的试验表明：一些化合物可对于啮齿类动物具有致癌作用，而在Ames试验或其它诱变试验系统则呈现阴性。用于致癌物筛选的短期试验如下：①基因突变试验：鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验(Ames试验)，培养哺乳动物细胞TK或HPRT正向突变试验；②染色体畸变试验：体外细胞系细胞遗传学分析，小鼠骨髓微核试验，大鼠骨髓染色体畸变试验；③原发性DNA损伤：DNA加合物，链断裂，DNA修复诱导(细菌SOS反应，大鼠肝UDS诱导)，SCE试验；④体外细胞转化：叙利亚地鼠胚胎细胞，Balb／c3T3细胞。哺乳动物细胞转化试验是体外试验，是一种遗传毒理学试验。在第六章中介绍的遗传毒理学试验的遗传学终点为基因突变、染色体畸变、DNA原发性损伤和非整倍体，而体外细胞转化则是另一个重要的遗传学终点。[体外细胞转化试验是检测受试物对体外培养的哺乳动物细胞转化的遗传毒理试验。是将动物细胞在体外培养的环境下，将细胞暴露于致癌物，高度模拟致癌物在体内致癌的作用进行致癌物检测的一种技术，可以有效的体外筛查致癌物质的致癌活性。不仅可以检测具有遗传毒性的潜在致癌物，还可以检测非遗传毒性致癌物的致癌活性。体外细胞转化试验是以所培养的细胞发生恶性转化从而产生的形态改变为试验终点，可直接在体外观察并记录细胞由正常转化为具有肿瘤细胞性质的过程。]四个短期试验系统分别与动物诱癌试验结果相对比可见Ames试验与动物试验相关显著性最高，特异性亦最高（91%），但敏感性最低（48%）。Ames试验阳性预测率亦最高（89%）。姐妹染色体交换与小鼠淋巴瘤试验则敏感性较高（分别为69%与72%），但阳性预测率低（64%，63%）。由此可见Ames试验对于诱变作用的致癌性可检出大部分，但对于无诱变性的致癌物则不能准确判定。当前短期试验在预测致癌性方面所遇到的最大问题是如何检出非诱变性致癌物。一些化合物可通过影响细胞的自稳状态或代谢，通过引起炎症或抑制修复过程，或者影响细胞增殖周期、细胞分化、基因表达程度等方面作用于致癌过程。这些作用利用现有的短期试验无法检出。迄今为止，只有动物诱癌试验可以准确判别人类致癌物的致癌性。二、哺乳动物短期致癌试验哺乳动物短期致癌试验又称为有限体内试验，指时间有限(数月)，靶器官有限。较受重视的短期致癌试验有下列四种：1.小鼠皮肤肿瘤诱发试验，于小鼠皮肤局部连续涂抹受试物，以观察皮肤乳头瘤和癌的发生，一般20周可结束实验，较敏感的小鼠为SENCAR小鼠。此试验也可设计为检测受试物的引发活性或促长活性。典型的引发剂为致癌性多环芳烃，促长剂为佛波醇酯(TPA)。2.小鼠肺瘤诱发试验。染毒途径常用腹腔注射，也可灌胃或吸人，一般30周可结束实验，观察肺肿瘤的发生。较敏感的小鼠为A系小鼠。此试验也可设计为检测受试物的引发活性或促长活性。典型的引发剂为乌拉坦，促长剂为二丁基羟基甲苯(BHT)。3.大鼠肝转化灶诱发试验。对大鼠进行肝大部切除术后，给以受试物，一般可在8-14周结束实验，观察肝转化灶生成。肝转化灶是癌前病变，有r—谷氨酰转肽酶(r-GT)活性升高，G6P酶(G6Pase)和ATP酶(ATPase)活性降低，以及铁摄取能力降低。转化灶可用组织化学或免疫化学方法鉴定。此试验也可设计为检测受试物的引发活性或促长活性。典型的引发剂为二乙基亚硝胺(DEN)，促长剂为苯巴比妥(PB)。4.雌性大鼠乳腺癌诱发试验，一般可用SD大鼠(或Wistar大鼠)，实验周期为6个月。此四个试验不是成组试验，应根据受试物的特点选择使用。此四个试验任一试验得到阳性结果的意义与长期动物致癌试验相似，但阴性结果并不能排除受试物的致癌性。三、转基因小鼠在致癌作用的研究转基因小鼠可用于研究在致癌过程中特定基因的作用，可用于分析化学物-基因的相互作用。可分为3类。1.转癌基因小鼠。与转录启动子连接的癌基因转入后可直接在某些特定的组织中高效表达，使该组织细胞处于引发状态，这类转基因动物是研究化学物致癌作用的敏感体系。携带癌基因的转基因动物可用于致癌试验，试验周期仅3个月左右，有希望发展成代替长期动物致癌试验的试验系统。这些携带有癌基因的转基因动物，可用来研究外源化学物与肿瘤相关基因的作用及外源化学物在致癌不同阶段中的作用机制。以各种组织特异性的促长剂处理转入不同癌基因的小鼠，可为致癌过程的研究提供新线索。2.肿瘤抑制基因敲除小鼠。在P53-／-小鼠，肿瘤(特别是淋巴肉瘤)的发生比正常小鼠(P53+／+)增加而且提前。由于P53-／-小鼠的肿瘤发生具有组织特异性，进一步研究这些肿瘤的遗传学基础有助于鉴定P53基因的功能。而半合子小鼠(P53+／-)在出生后6个月内自发癌发生率低，但在之后发生淋巴瘤和软组织肉瘤，其中大部分丢失P53野生型等位基因。这种小鼠对遗传毒性致癌物敏感性并不增加。这种半合子小鼠也可用于鉴定致癌过程中的协作基因。而且缺P53小鼠加速形成恶性肿瘤，提示此基因主要在进展阶段起作用。P53在肿瘤发生中的作用有待进一步研究。3.转穿梭质粒的转基因动物小鼠：转入带有报告基因的穿梭载体是研究体内基因突变的转基因动物模型。常用的靶基因如laeI、lacZ可通过噬菌体体外包装等方法，从小鼠基因组内回收，再在大肠杆菌内检测靶基因突变，可为研究不同器官基因的自发突变和诱发突变的分子机制提供有效的方法。二、动物诱癌试验一般认为动物诱癌试验结果对于判别化学物质致癌性具有很高价值，短期试验固然不能取而代之，即使是人类流行病资料，虽然在一定条件下，单独就可以证实是否属人类致癌物，但动物诱癌模型对于阐明其致癌原理，研究有关作用因素具有不可替代的作用。动物诱癌试验至今仍然是鉴定致癌性的重要条件，目前可用的化学致癌动物模型已有多种（表9一2）。短期试验固然不可取代动物诱癌试验，但短期试验对于帮助选择适当的动物试验受试物具有重要的价值。三、人群流行病学观察要判别人类致癌物，流行病学资料是具有决定意义的，甚至只根据完整的人类流行病学资料，即可判别某种物质是否为人类致癌物。砷化物即为一例。但完整的、可信的流行病学材料来之不易。过去流行病调查都以肿瘤发病数或死亡作为观察单位，其判别的准确性是无疑的。但这是属最后期的结果，不能用于早期发现、早期阻断。近年在流行病学研究中引进了生物标记，其中包括一些早期、中期生物标记，特别是分子水平标记的方法。使分子流行病学在一定条件下应用于判别某些化合物对于人类的致癌性、致癌危险性评价以及肿瘤化学预防的干预试验等方面。目前已在使用的化学致癌生物标记有以下几类：(1)接触标记可检查在细胞、组织或体液内某些致癌物的含量，用以衡量接触的水平，例如检查血清及脂肪组织内DDT、多氯联苯的浓度，吸烟者血清及唾液中N-甲-2-(3-吡啶基）-5-吡咯烷酮等。这类标记测定结果只说明机体接触情况，不说明所接触物质对机体，特别是靶细胞是否已起作用。另一方面可检查生物有效剂量，即检查致癌物到达细胞的剂量或反映与细胞大分子相互作用的程度。虽然所作用的细胞不一定是靶细胞而是它的替代物，但二者之间有一致的关系。目前常用的有各种致癌物-DNA加合物或致癌物-蛋白质加合物。由于这是致癌物经历体内一系列吸收、分布、排泄以及生物转化后在靶分子上所呈现的结果，比一般内剂量有更直接的生物学意义。(2）生物效应标记反映致癌物对于靶子或相类似部位所造成的损害，这些损害可能与肿瘤有关。这类标记很多，但最终能完全证明它与肿瘤发生的因果关系的标记为数尚不多。这类标记常用的有姐妹染色体交换（接触多种工业毒物、电离辐射），微核形成（有机溶剂、重金属、吸烟、咀嚼槟榔），染色体畸变（工业毒物、电离辐射、大气污染物），次黄嘌呤磷酸核糖转移酶（肿瘤化疗药物、电离辐射），MN血型糖蛋白（GPT），突变（肿瘤化疗药物、电离辐射）、肿瘤抑制基因（例如p53)突变（黄曲霉毒素），癌基因活化（多环芳烃、吸烟）等。(3)敏感性标记这是一类衡量致癌物反应性个体差异的标记。可用于检出肿瘤高危个体。目前多注意参与致癌物活化与灭活代谢的酶系多态性。以上三类生物标记在化学致癌研究中常用于三个方面：一是病因学研究，用以确立某种因素与某种肿瘤之间的因果关系。用一种特异性的生物标记作为观察终点，代替传统流行病学所选用的疾病或死亡终点，可达到早期判别、早期预防的目的。例如在20世纪90年代，有些学者以多环烃-DNA(PAH-DNA）加合物作为标记，观察工业大气污染及吸烟接触PAH后，白细胞内、肺组织内、胎盘组织内PAH-DNA的出现与分布规律。二是用于危险度评价。使用生物有效剂量衡量PAH的危险度比其它接触参数更为直接，是一次有应用前景的尝试。它比利用肿瘤发生率（或死亡率）作为观察指标更为敏惑，更有利于使危险度评价应用于预防。三是用于干预试验中临床流行病学观察。肿瘤化学预防的干预试验过去是利用肿瘤发生率的变化作为判别终点。凡能降低肿瘤发生率的物质就是具有化学预防作用，但是得到这一结果往往需要长至10年的观察期，这期间有很多干扰因素，要作出准确的结论是不容易的。致癌性判别不单纯是一个学术上的问题，而且和管理部门制定政策有密切关系。必须将短期试验、动物试验以及人群流行病学资料所得结果综合起来，详加分析，才能得出准确的结论。目前这三个方面试验的方法学仍然有许多不足之处，有待进一步完善。思考题