中药密蒙花对实验性干眼干预作用的研究

密蒙花对实验性干眼干预作用的研究

彭清华姚小磊王方彭俊李怀凤王芬陈佳文李海中吴权龙谭涵宇

湖南中医药大学

2017年11月17日于广州基金资助国家自然科学基金面上项目（编号：30772824）《密蒙花总黄酮治疗干眼症的拟雄激素效应研究》湖南省自然科学基金项目（编号：07JJ3049）《从拟雄激素效应探讨密蒙花提取物治疗实验性干眼症的干预机制》湖南省科技计划重点项目（编号：2009FJ3001）《密蒙花提取物滴眼剂治疗干眼症的临床疗效及其分子机理研究》湖南省科技攻关项目（编号：2015SF2016-6

）《治疗干眼症的中药制剂密蒙花滴眼液的临床前研究》湖南省发改委科技项目（编号：湘发改[2014]658号

）《一种治疗干眼症的中药制剂——密蒙花滴眼液的研制和开发》湖南中医药大学汇报目录研究背景与思路主要研究内容主要创新点主要研究结果一、背景与思路

干眼发病率高，对人类健康危害大。雄激素水平下降是引起干眼的重要原因之一，它通过增强局部炎症反应和细胞凋亡的途径，损伤泪腺等靶组织。此病目前主要采用人工泪液进行治疗，但仅能缓解其症状，不能针对性激素水平下降的病因，因此，寻找有效治疗药物，是当今国际前沿研究的热点。中医文献记载，密蒙花内滋肝阴、外散风热，切中干眼病机，现代研究表明，密蒙花的有效部位为黄酮，黄酮属于植物性激素，国外研究发现黄酮可以与雄激素受体结合，起到拟雄激素的效应。由此提出本项目研究思路：通过研究密蒙花总黄酮在泪腺等局部组织的拟雄激素效应，探讨密蒙花治疗雄激素水平下降所致干眼的实际效果和具体机制。湖南中医药大学二、主要研究内容密蒙花的三个药物层次1.初步提取物2.有效部位——总黄酮3.滴眼液药物制备动物模型

—动物去势法细胞模型

—泪腺上皮细胞的综合培养法建立模型从体内与体外两个方面（体内——整体动物水平）（体外——体外细胞水平）对密蒙花及其有效成分治疗干眼症的疗效及其作用机制进行研究，尤其着重观察其对炎症反应和细胞凋亡的影响。机制研究三、主要创新点2个理论创新点3个技术创新点理论创新点1.通过查阅中医古代文献，提出中药密蒙花新的适应症——治疗干眼。2.提出密蒙花总黄酮具有拟雄激素效应，可与雄激素受体结合，治疗雄激素水平下降导致的干眼。技术创新点1：新的提取方法创新了密蒙花总黄酮的提取方法既往存在极少数密蒙花总黄酮的提取方法，但我们在实际研究过程中发现这些方法所提取的总黄酮含量达不到我们所需，因此本项目经过反复摸索，发现采用醇提水沉法，加大孔树脂梯度洗脱的方法，是提取密蒙花总黄酮较好的方法，此法能使提取物的物质含量高于80%，且已经进行中试研究，适合工业化生产。技术创新点1：新的提取方法密蒙花总黄酮的提取工艺如右图75%乙醇回流提取两次，第一次10倍量，第二次8倍量药材烘干、打粉，过50目筛后，称量减压抽滤收集提取液，合并两次提取液减压浓缩至原体积1/8往浓缩液2中加入3倍量的水，3600r/min离心，过滤，弃渣滤液上大孔树脂，重复上两次水2倍体积30%乙醇2倍体积40%乙醇2倍体积梯度洗脱收集70%乙醇洗脱液70%乙醇2倍体积浓缩，60℃下干燥，粉碎成品进行HPLC检测，外标法计算蒙花苷含量平均17.292%，蒙花苷紫外标准曲线计算，得总黄酮含量为81.488%箭头所指为目标成分蒙花苷技术创新点2：新的动物模型在本研究之前，对于性激素水平下降所致干眼症的动物模型制作方法研究难以借鉴。本项目在原有研究基础上，通过改良，创造了新的干眼症动物模型制造方法——双侧睾丸及附睾切除的方法，可成功建立雄激素水平下降所致干眼症模型.并且，我们试验了两种动物：大鼠与白兔，均证明了去势方法可以建立理想的雄激素水平下降所致干眼症动物模型。白兔大鼠技术创新点2：新的动物模型以白兔动物模型为例，动物模型建立的相关指标结果表现为：去势后饲养3个月，实验兔表现出干眼症的泪腺局部炎症反应，TGF-β1的表达被抑制，促炎因子IL-1β、TNF-α的表达增强；泪腺组织细胞凋亡，促凋亡基因相关蛋白Fas、FasL、Bax

的表达增强，抑凋亡基因相关蛋白Bcl-2的表达减弱；从而加重泪腺细胞的炎性损伤与细胞凋亡，影响细胞分泌功能；通过对泪腺组织的破坏，去势后实验兔难以维持泪液的基础分泌量以及泪膜的稳定性，造成SIT（Schimer`sI试验）以及BUT（泪膜破裂时间）测量值减少。

湖南中医药大学技术创新点2：新的动物模型湖南中医药大学下图反映了正常动物与模型动物在泪腺细胞形态的区别：可见模型动物泪腺细胞核固缩、内质网紊乱、细胞变小等改变。白兔大鼠正常模型正常模型技术创新点3：新的细胞模型研究之初，采用其他报道的泪腺上皮细胞培养方法一直难以成功或传代。通过反复摸索，创造了新的大鼠泪腺上皮细胞培养方法——综合培养法。并在无文献报道可参考的情况下，创建了雄激素水平下降所致干眼的细胞模型。本研究采用无雄激素培养液，模拟雄激素水平低下的环境，并以含睾酮的培养液培养对照；并且应用H2O2诱导泪腺上皮细胞发生凋亡，由此模拟雄激素水平下降所致干眼症的细胞凋亡，而建立雄激素水平下降所致干眼的细胞模型。技术创新点3：新的细胞模型培养大鼠泪腺上皮细胞的具体方法取材部位取大鼠眶外泪腺。胶原酶的消化效果配制的浓度一般为2g·L-1，pH值以7.2-7.4为好，温度以37℃为宜。消化时间是最重要的，一般25min为好。泪腺上皮细胞的纯化反复贴壁法的应用及培养液中EGF及DXM的加入。培养瓶的包被低分子量多聚赖氨酸包被过的培养瓶，有利于细胞贴壁。细胞传代胰蛋白酶使细胞的分离速度快。但浓度太大不好控制消化的时间，而影响细胞贴壁。pH值为7.2最好。操作速度要快。技术创新点3：新的细胞模型36h72h10d鉴定四、主要研究结果1.密蒙花对雄性去势动物干眼症有良好的实验疗效，能有效改善雄性大鼠或兔去势后角膜和泪腺的组织结构，增加泪腺基础分泌量、维持泪膜稳定性。2.密蒙花总黄酮具有升高干眼症泪腺组织中雄激素受体表达的拟雄激素效应。3.密蒙花总黄酮具有通过拟雄激素效应以抑制干眼症模型局部细胞凋亡的作用。4.密蒙花总黄酮具有通过拟雄激素效应以抑制干眼症局部炎症反应的作用。5.密蒙花提取物制备成滴眼剂治疗实验性干眼症，同样具有抑制局部细胞凋亡等拟雄激素效应。湖南中医药大学研究结果（一）密蒙花对雄性去势动物干眼症有良好的实验疗效，能有效改善雄性大鼠或兔去势后角膜和泪腺的组织结构，增加泪腺基础分泌量、维持泪膜稳定性。

将实验动物（雄性大鼠或白兔）分为5组：包括正常组、假手术组、模型组、对照药物治疗组、密蒙花治疗组，采用前文所述的造模方法建立干眼症动物模型。造模后动物分别采用梯度时间饲养（白兔为饲养1个月，大鼠为饲养1、3、5个月）。饲养结束后，检测泪液基础分泌量、泪膜破裂时间、泪腺组织超微结构变化。湖南中医药大学研究结果（一）湖南中医药大学SIT测定结果密蒙花总黄酮可增加去势3个月及5个月后大鼠的SIT测量值（泪液分泌量），与雄激素相比无差异，但其效果随病程的延长其作用降低。BUT测定结果密蒙花总黄酮可提高去势3个月及5个月后大鼠的泪膜破裂时间（泪膜稳定性），并与雄激素相比无差异。02468101214空白组假手术组模型组雄激素对照组密蒙花治疗组123012345678空白组假手术组模型组雄激素对照组密蒙花治疗组135研究结果（一）湖南中医药大学SIT测定结果密蒙花提取物可增加去势1个月后白兔的SIT测量值（泪液分泌量）。BUT测定结果密蒙花提取物可增加去势1个月后白兔的泪膜破裂时间（泪膜稳定性）研究结果（一）电镜观察结果湖南中医药大学研究结果（二）密蒙花总黄酮具有升高干眼症泪腺组织中雄激素受体表达的拟雄激素效应。评价密蒙花有效成分的拟雄激素效应，为本次研究的关键。采用去势的方法建立的动物模型和细胞模型，雄激素下降已不可逆，本研究采用测定密蒙花治疗前后眼部组织中雄激素受体（AR）及其信使RNA（mRNA）的表达情况，以雄激素受体是否上调以及受体后效应，如对雄激素受体所影响的STAT1蛋白的表达，并测定血清中黄体生成素（LH）、睾酮（T）的含量变化，来评价拟雄激素效应。湖南中医药大学研究结果（二）整体动物水平实验将实验动物（雄性大鼠）分为5组：包括正常组、假手术组、模型组、对照药物治疗组、密蒙花治疗组，采用前文所述的造模方法建立干眼症动物模型。造模后动物分别采用梯度时间饲养（饲养1、3、5个月）。饲养结束后，观测泪腺组织AR、ARmRNA的表达，以及大鼠饲养前后的血清黄体生成素（LH）、睾酮（T）含量。湖南中医药大学研究结果（二）湖南中医药大学如图表所示，密蒙花总黄酮可增加泪腺中的AR的表达，与雄激素效果类似，但随病程的延长，其增强作用减弱，与雄激素的作用形成差异。研究结果（二）如图表所示，密蒙花总黄酮可增加泪腺中ARmRNA的表达，使AR的表达量升高，但随病程的延长，其增强作用减弱。密蒙花总黄酮可上调泪腺中的AR的含量，促进ARmRNA的表达，但随病程的延长，其上调作用减弱，并与雄激素的上调作用形成差异。研究结果（二）该表所示的是各组造模前和处死前的血清LH的测定结果，大鼠处死前，与其他各组相比，模型组LH表达明显增高，而其他各组LH之间无统计学意义。

研究结果（二）体外细胞水平实验取120只1月龄雄性大鼠的眶外泪腺，体外分离及培养泪腺上皮细胞。以H2O2诱导大鼠泪腺上皮细胞凋亡，建立雄激素水平下降所致干眼症的细胞凋亡状态。制备含药血浆，以MTT法摸索干预细胞的最佳加入量；同时设立空白血浆组、密蒙花总黄酮含药血浆干预组、丙酸睾酮干预组。观察各组AR、ARmRNA和STAT1磷酸化表达情况。同时，用氟他胺阻滞雄激素受体途径，再次观察AR以及STAT1表达情况。湖南中医药大学研究结果（二）各组均在相对分子量85000处有阳性条带出现条带。空白血浆组中AR蛋白有少量表达；密蒙花总黄酮含药血浆干预组中AR蛋白的表达增强，与空白组间的差异有显著性，但与丙酸睾酮干预组相比差异有显著性。湖南中医药大学Lane1：空白Lane2：中药Lane3：西药117000

85000组别123OD均值0.264±0.0560.591±0.075※△0.856±0.122※研究结果（二）密蒙花总黄酮含药血浆干预组中ARmRNA蛋白的表达增强，与空白组间的差异有显著性，但仍然不及丙酸睾酮干预组。

湖南中医药大学研究结果（二）空白血浆干预组中有少量STAT1表达；密蒙花总黄酮含药血浆干预组STAT1的表达量升高，与空白血浆干预组相比差异有显著性；密蒙花总黄酮含药血浆干预组中STAT1表达量比丙酸睾酮干预组表达量低。湖南中医药大学组别123OD均值0.169±0.0580.353±0.494※△0.502±0.036※Lane1：空白Lane2：密蒙花Lane3：睾酮9100041000空白血浆干预组：细胞质中有少量STAT1表达含密蒙花总黄酮血浆干预组：细胞质与细胞核中STAT1表达丙酸睾酮干预组：中细胞质与细胞核中STAT1表达对于各组细胞进行免疫组化法检测STAT1蛋白也发现：密蒙花总黄酮含药血浆干预组的细胞质与细胞核中STAT1表达增强。研究结果（二）AR表达量与STAT1表达量的相关与回归分析直线回归分析结果表明，各组STAT1磷酸化蛋白的表达与AR的表达有相关性（相关系数r=0.948），回归方程为：y=0.265+3.040x

表明由于STAT1为AR受体后下游的细胞因子，因此AR表达量与STAT1表达量具有相关性。研究结果（二）氟他胺干预后AR、STAT1磷酸化蛋白的表达用氟他胺干预泪腺上皮细胞后，AR及STAT1磷酸化蛋白的表达均无明显提高，且与空白血浆组间的差异无显著性。4100011700000085000Lane1：空白Lane2：密蒙花Lane3：睾酮9100041000氟他胺阻断雄激素受体后，AR蛋白在3组中的表达氟他胺阻断雄激素受体后，STAT1蛋白在3组中的表达研究结果（二）综合以上研究结果，得出以下结论：(1)密蒙花总黄酮含药血浆可与泪腺上皮细胞中的AR相结合，对泪腺上皮细胞中AR、ARmRNA产生上调作用，并且促进雄激素受体下游的STAT1蛋白的磷酸化表达，而发生拟雄激素效应，与丙酸睾酮相似。(2)用雄激素受体拮抗剂——氟他胺干预后，上述效应不明显。(3)密蒙花总黄酮能抑制去势后实验性干眼症大鼠血清中LH反馈性升高，从另一个侧面证实了密蒙花总黄酮有拟雄激素的作用。

湖南中医药大学研究结果（三）密蒙花总黄酮具有通过拟雄激素效应以抑制干眼症模型局部细胞凋亡的作用。动物造模、饲养、干预方法同前所述。饲养结束后，予以RT-PCR测定凋亡相关基因蛋白BaxmRNA及bcl-2mRNA在大鼠泪腺中的表达，免疫组织化学方法检测白兔和大鼠泪腺组织中Bax、bcl-2、Fas、FasL表达，用TUNNEL方法检测各组大鼠泪腺凋亡细胞。湖南中医药大学研究结果（三）实验兔各组细胞凋亡情况比较研究结果（三）大鼠的实验也出现与白兔实验相似的结果。实验大鼠各组治疗后Bax、bcl-2平均光密度比较实验大鼠各组凋亡细胞数量比较研究结果（三）湖南中医药大学密蒙花总黄酮干预后各组大鼠泪腺组织中的Bax的表达：Bax蛋白表达呈现棕黄色颗粒，发现密蒙花总黄酮可以使Bax蛋白的表达量降低，随延长时间的延长，其抑制效应无明显降低。研究结果（三）湖南中医药大学密蒙花总黄酮干预后各组大鼠泪腺组织中的Bcl-2的表达：Bcl-2蛋白表达呈现棕黄色颗粒，发现密蒙花总黄酮可以促进泪腺中的Bcl-2的表达，但随病程的延长，其促进作用有所减弱。研究结果（三）RT-PCR检测：密蒙花总黄酮含药血浆干预组中BaxmRNA的表达被抑制，与空白组和模型组的差异有显著性，与丙酸睾酮干预组相似，与Bax蛋白检测结果一致。

湖南中医药大学研究结果（三）RT-PCR检测：密蒙花总黄酮含药血浆干预组中Bcl-2mRNA的表达增强，与空白组和模型组的差异有显著性，与丙酸睾酮干预组相似，与Bcl-2蛋白检测结果一致。湖南中医药大学研究结果（三）由此得出结论：（1）密蒙花总黄酮能提高去势后实验性干眼症大鼠或白兔泪腺组织、角膜上皮细胞中bcl-2的表达，减低Bax

的表达。（2）密蒙花总黄酮可抑制去势后实验性干眼症角膜和泪腺组织中Fas

和FasL

的阳性表达。（3）密蒙花总黄酮含药血浆可抑制雄激素水平下降所致干眼症的泪腺细胞模型BaxmRNA的表达，促进Bcl-2mRNA的表达，而达到抑制细胞凋亡的作用。

湖南中医药大学研究结果（四）密蒙花总黄酮具有通过拟雄激素效应以抑制干眼症局部炎症反应的作用。

动物造模、饲养、干预方法同前所述。饲养结束后，予以免疫组织化学方法检测白兔泪腺组织中TGF-β1、IL-1β、TNF-α表达。湖南中医药大学研究结果（四）研究结果（四）研究发现：密蒙花总黄酮可通过刺激TGF-β1mRNA合成，促使TGF-β1的表达增加，而抑制IL-1β、TNF-α水平，进而产生同丙酸睾酮治疗干眼症的相似效果。TGF-β1的表达增加而抑制IL-1β、TNF-α水平，可能是雄激素水平下降所致干眼症中，其抑制角膜和泪腺组织细胞炎症反应的重要机制之一。湖南中医药大学研究结果（五）密蒙花提取物滴眼剂治疗实验性干眼，同样具有抑制局部细胞凋亡等拟雄激素效应。

将实验动物分为3组：包括空白组、模型组、密蒙花滴眼剂治疗组，采用前文所述的造模方法建立干眼症动物模型。造模后动物分别采用梯度时间饲养（饲养1、2