核酸分子杂交技术分子生物学检验技术生物化学检验教研室课件

分子生物学检验技术核酸分子杂交技术生物化学检验教研室学习目标掌握：1.核酸分子杂交的基本原理；2.核酸探针的种类分类，常用探针标志物。熟悉：核酸分子杂交的影响因素；核酸探针的检测方法。常用核酸分子杂交技术的基本原理，操作过程。了解：1.常用核酸探针标记方法的原理和特点；2.常用核酸分子杂交技术的临床应用。目录核酸分子杂交的基本原理与分类01核酸探针种类、标记方法02核酸分子杂交技术03CONTENTS分子生物学检验技术CONTENTS常用核酸分子杂交技术PART03常用核酸分子杂交技术杂交类型检测目的及范围Southern印迹杂交检测经凝胶电泳分离且转移至膜上的DNA分子Northern印迹杂交检测经凝胶电泳分离且转移至膜上的RNA分子原位杂交检测细胞或组织中的DNA或RNA分子菌落杂交检测固定在膜上,经裂解从细菌体释放的DNA分子斑点杂交检测固定在膜上的DNA或RNA分子分子杂交的一般程序待测核酸制备电泳滤膜上核酸固化杂交去除未杂交的探针检测杂交信号制备探针探针标记加入标记核酸探针分子杂交的一般程序1.待检2.电泳3a.印迹3b.合成标记探针AddKlenow

DNAPolymerase,

randomprimers

andlabeled

nucleotides4.杂交5.洗膜、显影Klenow

FragmentKlenow

FragmentSouthern印迹杂交DNA/DNA杂交，将DNA电泳、转印到固相支持物上，用探针进行检测的方法。琼脂糖凝胶电泳印迹技术分子杂交技术琼脂糖凝胶电泳分离DNA不同的DNA，分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。根据分子的大小进行分离。印迹技术将核酸分子通过一定方式转移并固定到固相支持物（硝酸纤维膜）上毛细管虹吸法重物湿滤纸吸水纸玻璃板胶膜湿滤纸湿滤纸桥支持平台玻璃容器20×SSC电转移Southern杂交的应用用Southern检测物种1和物种3的特异性的DNA片段从样本中提取DNA123Southern杂交的应用限制性内切酶酶切DNA123Southern杂交的应用消化后DNA经琼脂糖凝胶电泳分离123Southern杂交的应用消化后DNA经琼脂糖凝胶电泳分离，经印迹技术转到尼龙膜上123Southern杂交的应用附着DNA的膜经预杂交后与标记探针进行杂交123Southern杂交的应用经放射性自显影检测与探针序列互补的特定DNA片段123Southern杂交的应用分离转移杂交放射自显影酶切流程图制备基因探针杂交根据杂交片段显示的长度多态性分析限制性内切酶MstII待检测基因，不同长度片段Southern杂交的应用如何用Southern印迹诊断镰刀型红细胞贫血症的？镰状细胞贫血症临床表现慢性溶血性贫血易感染再发性疼痛危象发病机制β珠蛋白基因镰刀型HbS缬氨酸GTGCACβ珠蛋白基因正常HbAGAGCTC谷氨酸缺失了一个MstII酶切位点（回文结构）Southern杂交的应用ATΧASouthern杂交的应用CCTAGGCCTGAGGACCTAGG==MstIIMstIIMstII5’3’1.15kb0.2kbCCTAGGCCTGTGGACCTAGG==MstIIMstIIΧ3’5’1.35kb提取待检者全基因组DNA12Southern杂交的应用341234MstII酶切后电泳分析Southern杂交的应用1.35kb1.1kb0.1kb0.6kb0.8kb0.3kb1.4kb与β-珠蛋白基因特异性探针杂交Southern杂交的应用βA/βA

βA/βS

βS/βS

βA/βS

24131.35kb1.1kb0.2kbNorthern印迹杂交/NorthernblotNorthern印迹杂交是应用DNA探针检测特异mRNA的另一种膜上印迹技术。是由Alwine于1977年建立的。Northern印迹杂交/Northernblot基本原理和基本过程与Southernblot基本相同。01鉴别RNA。02探针可用DNA或RNA片段。03待测样品为总RNA或mRNA。04Northern印迹杂交/Northernblot变性电泳提取组织总RNA转膜预杂交制备探针探针设计标记探针纯化探针Northern杂交杂交后检测结果分析Northern杂交的应用待检样品分离纯化RNA逆转录PCR与丙型肝炎特异性探针进行点杂交HCVRNA病毒检测Western印迹杂交/Westernblot1979年，Towbin等人首先将印迹术引入对抗原（蛋白质）的检测——免疫印迹，Western印记杂交。基本过程首先做蛋白质的SDS电泳。01然后将凝胶中的蛋白质电转印到固相膜上。02在膜上以相应的抗体进行抗原／抗体反应。03显色。04本方法结合了凝胶电泳分辨率高和免疫检测灵敏特异的特点，能从混杂的蛋白质中检测出特定的抗原。三种印迹技术的比较点杂交/Dot-blot将待检样（DNA、RNA或细胞）直接点样到固体膜上，然后与特异性探针进行杂交并检测。点杂交/Dot-blot点杂交/Dot-blot用点杂交诊断镰刀型红细胞贫血症发病机制β珠蛋白基因镰刀型HbS缬氨酸GTGCACβ珠蛋白基因正常HbAGAGCTC谷氨酸用点杂交诊断镰刀型红细胞贫血症分子诊断点杂交/Dot-blotSouthern印迹杂交。01点杂交印迹杂交。02点杂交/Dot-blotβA5’GTGCACCTGACTCCTGAGGAGAAGTCTGCC…..3’野生型βAASO14βS5’GTGCACCTGACTCCTGTGGAGAAGTCTGCC…..3’AGGAGAAGTC3’5’TGACTCCTG突变型βsASOTGGAGAAGTC3’5’TGACTCCTG点杂交/Dot-blot点样待检基因样本杂交与两种探针分别判读结果野生型突变型βA/βA

βA/βS

βS/βS总结条件设计杂交针对突变位点已知的基因。

一对寡核苷酸探针：一条为野生型探针，与正常序列互补；一条为突变型探针，与突变序列互补。分别与受检者DNA进行分子杂交。总结点杂交/Dot-blot反向点杂交/ReverseDot-blot，RDB正向将待检样（DNA、RNA或细胞）直接点样到固体膜上，然后与特异性探针进行杂交并检测。反向将特异性探针直接点样到固体膜上，然后与待检样（DNA、RNA或细胞）进行杂交并检测。反向点杂交的临床应用项目名称标本类型检测方法地中海贫血基因突变检测全套（α+β）EDTA抗凝血gap-PCR、PCR-RDBα地中海贫血基因检测（包括缺失和突变）EDTA抗凝血gap-PCR、PCR-RDBβ地中海贫血基因突变检测EDTA抗凝血PCR-RDB反向点杂交的临床应用01遗传性疾病检验苯丙酮尿症。02感染性疾病检验乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒。原位杂交/Insituhybridization13号，绿色荧光；21号，红色荧光原位杂交/Insituhybridization核酸探针进入细胞或组织中，与待测核酸进行杂交，然后用组织化学或免疫组化的方法在显微镜下进行细胞内定位的检测。保持细胞形态，或单个染色体形态下完成；不用提取核酸；可精确定位。原位杂交/Insituhybridization根据探针标记物分类放射性原位杂交荧光原位杂交技术（FluorescenceInSituHybridization，FISH）原理01设计根据待测核酸序列信息合成带标记的特异性探针。02制备待测样本（组织切片，细胞爬片），适当处理增加细胞膜的通透性。03变性复性序列互补的待测核酸与特异性探针结合。04观察用探针标记物相应的检测方法，定位检测观察。原理原理放射性原位杂交菌落原位杂交特异性的基因探针从细菌菌落群中筛选含有目的基因的阳性菌落。印迹菌落裂解固定DNA预杂交与标记探针杂交确定阳性菌落位置回收荧光原位杂交/FISH用荧光素标记的探针与待测样本中的靶核酸进行原位杂交，在荧光显微镜下对荧光信号进行辨别和技术，达到对染色体或基因异常的细胞或组织标本进行检测诊断。21三体综合征的FISH产前诊断21号染色体的特异性探针（红色）13号染色体的特异性探针（绿色）与羊水间期细胞进行荧光原位杂交FISH20号染色体微缺失的FISH检验20号染色体着丝粒探针（红色）20号染色体基因座特异性探针（绿色）与待检细胞进行FISH杂交FISH检测染色体易位染色体核型分析检测染色体易位20号染色体微缺失的FISH检验荧光原位杂交的临床应用先天性疾病（唐氏综合症）01肿瘤疾病检验（慢性粒细胞白血病）02感染性疾病HPV，HBV03标本01