（高清版）DB37∕T 2947-2017 鲟鱼人工繁殖技术规程　

DB37DB37/T2947—2017鲟鱼人工繁殖技术规程2017-042017-04-2017-05-山东省质量技术监督局发布IDB37/T2947—2017本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由山东省海洋与渔业厅提出。本标准由山东省渔业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：山东省淡水渔业研究院、山东省农科院信息工程研究所。本标准主要起草人：陈有光、于振海、卢红、王玉新、王剑非、郑玉珍、轩子群。1DB37/T2947—2017鲟鱼人工繁殖技术规程本标准规定了鲟鱼人工繁殖的环境条件、亲鱼培育、人工催产、精液采集与保存、鱼卵采集、人工授精、脱粘、孵化、出苗及疾病防治等操作规范。本标准适用于施氏鲟、西伯利亚鲟、鲟蝗杂交种的苗种人工繁育，其他鲟鱼种类可参照使用，匙吻鲟不适用。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB11607渔业水质标准NY5071无公害食品渔用药物使用准则NY5072无公害食品渔用配合饲料安全限量SC/T1086施氏鲟养殖技术规程亲鱼培育池应为流水、微流水池塘。长方形池塘，面积200m²~500m²,池深1.2m~1.5m;或圆形池塘，直径7m~8m,池深1.2m~1.5m,池底中央排水，池塘坡度不大于1:20。水源充足，每口池塘应设有独立的给排水系统；水质应符合GB11607的规定，其中养殖水中溶氧大于5mg/L。来自于持有国家发放的良种生产许可证的良种场人工养殖的鲟鱼。不得使用近亲繁殖的后代作亲4.2.1形态特征、可数与可量性状亲鱼外部形态特征、可数与可量性状可参考SC/T1086。2DB37/T2947—20174.2.2繁殖年龄和体重允许作为繁殖用亲鱼的最小年龄和最小体重可见表1。表1繁殖用亲鱼的最小年龄和最小体重亲鱼性别性腺成熟年龄，龄允许繁殖的最小年龄，龄允许繁殖的最小体重，kg雌/早雄/合4.2.3雌鱼选择性成熟的个体胸腹部浑圆柔软而有弹性，腹部凹陷钩状，生殖孔红润外突，也可用挖卵器从雌鱼体内取出卵子，目测卵呈灰黑色、椭球形，用卡尺量卵径长轴和短轴均大于2.75mm,挑选鱼卵极化指数小于1/20的雌鱼用于催产。鱼卵极化指数参见附录A。4.2.4雄鱼选择性成熟的个体胸腹部平整坚硬，在发情期或生殖期生殖孔较紧不外突，两侧轻挤压有乳白色的精液流出；也可穿刺取性腺，目测性腺呈白色或乳白色，显微镜压片检测可见到精子。4.3亲鱼放养4.3.1专池培育经选择达到可以进行繁殖的亲鱼，可雄雌单性专池培育，也可以雄雌混养。利用自然或者机械降低亲鱼养殖池水温到10℃以下、维持1个月以上，然后每天逐步升温小于3℃,将水温提升至15℃,亲鱼性腺发育达到IV期的时候，可进行人工催产。鲟鱼性腺分期方法参见附录B。雄雌亲鱼分开单独放养，等待人工催产。产后亲鱼要单性专池培育。4.3.2.1放养密度雌、雄亲鱼应分池，进行单性培育。雌亲鱼放养规格在10kg~15kg,亲鱼池放养密度为5m²~10m²水面1尾。;雄亲鱼放养规格在5.5kg~12kg,亲鱼池放养密度为2.5m²~5m²水面1尾。4.3.2.2水体交换产卵季节池水交换不小于1次/6h,其他季节池水交换不小于1次/24h。4.4亲鱼投喂4.4.1饵料可以使用鲜活饵料或配合饲料，鲜活饵料宜用鱼、虾、螺、蚌等。应切碎、除壳后投喂。饲料应该新鲜，安全质量应符合NY5072的规定，腐败变质的饲料不应使用。4.4.2投喂次数和投饲量亲鱼入池后，即应投饲。每天早、晚各1次，配合饲料的日投饲量为亲鱼体重的0.5%～1.0%。根据摄食情况进行调整。3DB37/T2947—20174.5日常管理亲鱼培育期间应加强管理，做好以下工作：——每天早、晚巡池2次。注意观察亲鱼活动情况，做好饲养记录，发现问题及时解决。——产卵亲鱼应做标记，建立档案，记录亲鱼的产卵时间和年龄，卵的质量和数量，受精卵孵化率及鱼苗成活率。——加强鱼病的防治，方法可见附录C。人工催产药物可选用促黄体素释放激素类似物(LRH-A)单独使用，或者促黄体素释放激素类似物雌鱼一般为两次注射，第一次注射10%的剂量，10h~12h后注射90%的剂量；雄鱼一次注射，在雌鱼第二次注射前2h～6h注射。注射部位有背鳍基部肌肉注射和胸鳍基部注射两种方法，背鳍基部注射采用较多。进针深度1.0cm~1.5cm。注射操作完成后拔针头时，应用手指轻轻按住注射处使药物尽量不外流。6.1采集时间注射催产药物8h~10h开始检查雄鱼，轻压雄鱼腹部时发现乳白色精液流出，镜检精子快速运动时间不低于30s,即可开始采集精液。初次采集后每隔2h~3h检查并采集1次，一般可以采集3次~46.2采集方法6.2.1采集工具消毒所有使用的采集工具均需消毒。6.2.2导管吸出法将医用导管与医用注射器前端相连，用干燥毛巾将生殖孔周围体表擦干；轻压腹部有少量精液排出时，将导管深入雄鱼生殖孔内，用注射器抽取精液。宜使用内径3mm、长度5cm的医用导管和100mL的医用注射器。4DB37/T2947—20176.3精液保存将取出的精液移入干燥烧杯中，封口后放入冰箱0℃~4℃保存。采出后和使用前的精液均用显微镜进行精子活力检测。7鱼卵采集7.1鱼卵采集时间雌鱼催产药物注射4h后，应每隔1h检查1次亲鱼，当接近排卵时，应30min检查1次。当雌鱼出现排卵时，游动活跃，不时撞击水面，卵巢有流动现象，有卵粒涌出，即可采卵。采卵时间掌握在排卵开始的90min左右，不宜超过150min,否则影响受精率。7.2挤压法用干燥毛巾擦干生殖孔周围，挤压腹部两侧，将鱼卵挤入干燥容器内。挤压法采卵需间隔1h~2h多次采集，直到挤压腹部无鱼卵排出为止。7.3微创手术法7.3.1手术工具消毒所有使用工具均应消毒。7.3.2手术方法使用间氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐(MS-222)100mg/L或丁香酚50mg/L麻醉雌鱼，然后固定在操作台上，用75%酒精消毒腹部，用手术刀在距生殖孔前方10cm左右的腹部中线一侧切一个3cm~5cm切口，从鱼体腹部两侧由头部向尾部反复挤压，将鱼卵从切口处挤出，直至很少的卵粒从开口处流出为止。然后，在开口处向鱼体内灌入生理盐水，每次加入500mL～1000mL,挤压鱼体腹部，排出体内剩余的游离成熟鱼卵，反复2～3次再也挤不出鱼卵后，可结束人工采卵工作。7.3.3切口缝合方法鱼卵全部取出后，用聚丙烯丝线缝合切口，手术切口采用交叉针法、8针4结缝合，并对缝合部位用碘酊和70%乙醇消毒。整个手术用时需控制在50min内。术后亲鱼放入暂养池饲养恢复。恢复期间水温13℃~17℃,溶解氧8mg/L～10mg/L。每日现察鱼的活动情况，第3天检查一次切口愈合情况。7.3.4手术后雌鱼护理缝合后给雌亲鱼注射抗生素药物，把受伤雌鱼放入专门护理水泥池中，每日注射抗生素，剂量为每千克亲鱼体重50万单位～80万单位青霉素，持续时间为10d左右。亲鱼手术后15d内每天检查亲鱼刀口，检查刀口恢复情况和缝合线是否脱落等。同时投喂适口的人工配合饲料，并注意保障养殖用水的清新。8人工授精8.1精液密度根据精液浓度及精子活力确定使用精液体积，精子的质量体积比为1.13g/mL。5DB37/T2947—2017每千克鱼卵使用精液为10mL～20mL。8.3授精方法根据鱼卵总量，计算需要的精液量。将精液经镜检后与鱼卵混合，用羽毛搅拌均匀后，按1千克鱼卵加水1千克再搅拌3min～5min进行人工授精，避光操作。9脱粘使用医用滑石粉配成20%～30%的滑石粉悬浊液，将受精卵倒入含有该溶液的容器内，用手工或脱粘装置宜搅动40min~60min,轻轻搅动受精卵直至受精卵分散呈颗粒，静置不结块。每千克受精卵使用10L~15L滑石粉悬浊液。为防止缺氧，搅动20min～30min后，更换一次滑石粉悬浊液。选用麦克唐纳瓶式孵化器，孵化器应架设水槽，使孵出鱼苗直接流入集鱼箱或鱼苗培育池。保持水温15℃~16℃。溶氧不小于6mg/L。避免阳光直射。经过不小于150目的筛绢过滤，避免将敌害生物带入。流水孵化。水的流量30L/min,可孵化32kg受精卵，约32×5×1受精卵孵化6d±1d开始出苗；温度越低，孵化时间越长。6DB37/T2947—201710.4孵化管理10.4.1日常管理孵化期间应有专人值班，观察检查孵化设备的运转情况，鱼卵的发育状况，及时清除死卵、坏卵，防止水霉生成。检查与清洗滤水设备，保持滤水流畅。做好值班记录。计数出膜的鱼苗，并将其及时移入鱼苗培育池。10.4.2水霉控制孵化期间应及时拣出死卵。水霉病的防治见附录C。10.4.3受精率统计在鱼卵发育到原肠中后期时，开始统计受精率。11疾病防治11.1防治原则坚持以预防为主、防治结合、防重于治的原则。11.2防治药物的使用应按NY5071的规定执行，并按《水产养殖质量安全管理规定》做好有关记录。11.3主要疾病的防治主要疾病的防治可见附录C。7(资料性附录)鲟鱼卵极化指数的计算方法成熟卵细胞呈椭球形、黑灰色。用挖卵器从雌鱼体内取出卵子，将卵子放入水中煮2min～3min,将鱼卵放在通风、阴凉的地方，待表面干燥后，用刀片沿卵的长轴切开，计算极化指数。极化指数计算方法见公式(1)。式中：PI——极化指数；I₁——鱼卵动物极到卵核的最短距离；I₂——鱼卵动物极到植物极的距离。8DB37/T2947—2017(资料性附录)鲟鱼雌性性腺发育分期方法卵巢呈白色半透明窄带状，肉眼看不见卵粒，辨认不出卵巢与精巢。切片可见到卵巢中的生殖细胞是以第I期的卵原细胞为主，细胞质很少，细胞直径在10μm~60μm,最小的卵原细胞直径10μm,细胞核直径7.5μm,细胞核大占据了卵原细胞的大部分体积，核直径为7.5μm~38.5μm,核丝状均匀分布，又可称染色质核期。细胞核内只见核质还没有核仁出现。B.2第Ⅱ期卵巢卵巢乳白色中略见淡淡黄色，肉眼可见半透明状针眼大的卵粒，低倍光镜下能见到丰富的脂肪组织包裹着卵巢，卵巢表面分布着大小不同的卵。切片观察，卵巢组织内也有大量的脂肪，占卵巢整体的大部分。卵巢中的生殖细胞是以第Ⅱ期卵巢的初级卵母细胞小生长期的细胞为主，细胞呈多角圆形，初级核仁(7个~26个)靠近核膜内侧环形分布，也可称为外周核仁期。部分细胞质可见到网状结构。初级卵母细胞外面已有滤泡膜。随着初级卵母细胞的生长发育，细胞质的嗜碱性减弱，少部分初级卵母细胞很大，卵径在400μm左右。B.3第Ⅲ期卵巢卵巢有浅灰色和深褐色两种，表面分布着浅灰色或深褐色卵粒，卵巢组织内仍有大量的脂肪。卵巢内生殖细胞是以第Ⅲ期进入大生长期的初级卵母细胞为主，可以分为早、中、晚3个相的发育阶段。初级卵母细胞的早期，细胞直径在200μm~500μm之间，细胞质占细胞体积的大部分，嗜碱性减弱，细胞质有颗粒物质并形成环层，脂肪滴出现在核的外周。核仁数量明显增加(29个~35个),核膜内侧环形排列，与细胞质相比核已小得多了。中期，卵细胞直径在500μm~900μm,细胞膜有完整的3层结构，卵黄颗粒在细胞质外环出现，脂肪滴数量增加并向细胞质外环移动，卵巢中卵细胞进行有丝分裂，数量大大增加。晚期，细胞直径为900μm~1600μm,细胞为椭圆形，随着卵细胞的生长发育，核仁数量迅速增加 (200个~400个),同时卵黄颗粒的数量也在增加，卵黄颗粒体积加大成为卵黄小体，分布于细胞质的大部分区域，由卵黄颗粒的分布使细胞质分成5层，靠近细胞膜和核的2窄层为无卵黄颗粒分布层，靠这2窄层的2层是小颗粒层，中间是大颗粒层，细胞质最外层出现色素颗粒。此期细胞核在中央没有发生极B.4第IV期卵巢卵巢灰黑色，体积很大，卵巢重是亲鱼体重的15%～20%。9DB37/T2947—2017卵巢内生殖细胞是以第IV期发育晚期的初级卵母细胞为主，细胞体积增大，长轴直径为1600μm~3300μm左右。根据卵母细胞直径的大小和核偏移的情况，发育晚期的初级卵母细胞又可划分为早、中、晚3个发育阶段。早期，卵母细胞长轴为1600μm~2000μm,细胞质分5层，卵黄小体聚集成卵黄小板和大的脂肪滴分布在中间层，并偏向长轴的一侧，靠细胞膜的小卵黄颗粒层内出现色素颗粒，核位于中心，核膜消失，核仁移向中央，均匀分布并被无卵黄颗粒的细胞质环绕。中期，卵母细胞长轴为2000μm~2600μm,细胞核开始由中央直接呈三角形状移向动物极，不含卵黄的细胞质也随着卵核向受精孔方向移动，卵母细胞进入成熟期。细胞质的5层分布消失，卵黄小板和脂肪滴集中在细胞质外周和植物极，卵黄颗粒和脂肪滴充塞了卵母细胞的大部分体积。晚期，卵母细胞长轴为2600μm～3300μm,核仁完全溶解在核浆中，核向动物极的卵膜靠近。卵膜在切片上可见3层结构。卵膜外附着薄膜状，松散起伏不平的是滤泡膜。卵膜最外层为胶膜或蜂窝膜，中间为卵黄外膜，里侧是卵黄内膜。3层膜都有相对应的辐射纹，卵黄内膜很薄，与卵黄外膜紧密结合。3层卵膜中最厚的是胶膜，卵黄外膜较胶膜略薄，卵黄内膜最薄。晚期的初级卵母细胞的卵膜，较大生长期的初级卵母细胞的卵膜明显增厚，约35μm~40μm。根据细胞核偏移情况将该期卵母细胞分为早、中、晚3个发育阶段。当卵细胞发育到中期阶段时，细胞核向动物极移动，开始极化。到IV期末，核极化到PI值小于0.1左右，可以进行人工催产繁殖。B.5第V期卵巢卵巢松软，成熟卵细胞从滤泡膜内释放，直接落入腹腔。鲟成熟卵细胞呈椭球形，有长轴和短轴，动物极顶端有一浅色亮点，为极斑，极斑被深浅相间的环所环绕，为极环。卵的极环到极斑约占卵体的1/3。第V期的卵母细胞，是由初级卵母细胞经过第一次成熟分裂成为次级卵母细胞，进而发育到第二次成熟分裂中期的成熟卵细胞，细胞核呈一团的核质状，卵细胞的原生质集中在核周围，形成胚盘原基，并接近受精孔。细胞膜的辐射纹消失。第VI期卵巢的卵已经产出，卵巢松弛，充血，呈红色或紫红色。未产出的卵会退化凋亡被鱼体吸收，卵巢内除少量残留第IV期卵母细胞外，主要为第Ⅱ期的初级卵母细胞、大量的空滤泡和发达的结缔组织。DB37/T2947—2017(资料性附录)常见鲟鱼病害及防治方法表C.1常见鲟鱼病害及防治方法病名病原症状防治方法小瓜虫病小瓜虫病(Ichthyophth-iriasis)鱼体的躯干、头、鳍、鳃、口腔等处都布满小白点，同时伴有大量黏液，患病鱼体消瘦，行动缓慢，经常与池壁或池底摩擦。用显微镜可确诊。用150mL/L福尔马林在培育池中处理30min,需连续处理数次，每天1次；或全池遍洒亚甲基蓝，使池水成2mg/L浓度，连续数次，每天1次。车轮虫病车轮虫(Trichodinaspp)和小车轮虫(Trichodincllaspp)属缘毛目、游动亚目(Moleilina)、壶形科主要寄生在鱼苗的体表与鳃上，少量寄生时，无明显症状，严重感染时，引起寄生处黏液增多，鱼苗游动缓慢，引起鱼不安，行