进出口化妆品中病原菌检测方法 微滴式数字PCR法 第3部分：铜绿假单胞菌_第1页
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进出口化妆品中病原菌检测方法微滴式数字PCR法第3部分：铜绿假单胞菌本文件描述了进出口化妆品中铜绿假单胞菌的微滴式数字PCR检测方法。本文件适用于进出口化妆品中铜绿假单胞菌的快速检测。本文件所能达到的检出限(LODm)为0.50CFU/g(mL)-1.37CFU/g(mL)。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，共最沥版本(包括所有的修改单)适用于本文件。分析实验室用水规格和试验方法实验室生物安全通用要求实验室质量控制规范食品分子生物学检测化妆品微生物检验制样规范化妆品安全技术规范3术语和定义本文件没有需要等定的术语和定义。4缩略语下列缩略语适用于本文件。DNA:脱氧核糖核酸(DeoxyribonucleicAcd)dAPCR:微滴式数字PCR(dropletdigitalPdyineraseChainReaction)PCR:聚合酶链式反应(PolymenseChainReaction)16SrRNA:168核糖体RNA(16SribosomalRNA)5方法原理针对铜绿假单胞菌16SrRNA编码基因的保守序列设计引物、探针。将一定浓度的引物、探针与模板DNA及数字PCR反应预混液混合，配成PCR反应体系。将该数字PCR体系分布到12000个-20000个微滴中。使大部分微滴中模板DNA分子的数量为1或0,然后进行PCR扩增。16SrRNA探针5'端标记VIC荧光基团，3'端标记BHQ1。利用数字PCR系统的检测通道。可对每个微滴的荧光信号进行采集分析。含有模板DNA的微滴出现荧光信号的增强，形成阳性微滴簇。最终根据阳26.2冰箱：2℃-8℃、-20℃。吸取10mL1:10样品稀释液接种到90mLSCDLP增菌液中，置于36℃±1℃培养箱培养用生理盐水清洗沉淀1次~2次。用1mL生理盐水混悬沉淀，于10000g-12000g离圣4p—DNA浓度，单位为纳克每微升(ng/L);A—260nm处的吸光值；N—核酸稀释倍数。A/4m在1.8~2.0之间，DNA浓度为0.01ng/μL~10ng/pL时，适用ddPCR检测。9.5.1对照和平行检测过程中分别设置阳性对照、阴性对照和空白对照。以铜绿假单胞菌标准菌株DNA或含目的片段的DNA作为阳性对照，以非铜绿假单胞菌标准菌株DNA作为阴性对照。用等体积的一级水代替模板DNA作为空白对照。每个待检样品提取的DNA溶液进行3个平行ddPCR检测。9.52反应体系按照表1配制dIPCR反应体系。"一一水一一一9.5.3微滴生成将配制好的ddPCR反应混合液，加人微滴生成装置加样孔中，按仪器操作说明生成微滴。将生成的微滴八连管加盖后，缓慢转移至PCR仪上。按以下参数进行FCR扩增：95℃30s;94℃10s,57℃30s,40个循环；12℃10min。升降

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