医学微生物学与免疫学实验指导

医学微生物学与免疫学实验指导

目录

实验目的与要求

实验室规则

医学免疫学实验

体液免疫检测

临床常用的抗原抗体反应

实验一、凝集反应

一、直接凝集反应

二、间接凝集抑制反应

三、ABO血型鉴定法

实验二、沉淀反应

一、双向琼脂扩散

二、单向琼脂扩散

三、对流免疫电脉

四、火箭电泳

实验三补体结合试

免疫标记技术

实验四荧光抗体技术

实验五放射免疫测定

实验六醐联免疫吸附试验

细胞免疫检测

实验七T细胞计数

一、E攻瑰花结试验”

二、Ea玫瑰花结试验

实验八淋巴细胞转化试验

实验九移动抑制试验

实验十T细胞亚群检测

实验十一白细胞介素2检测

医学微生物学实验

细菌学

细菌形态学

实验一微生物学实验室常用仪器

实验二显微镜油镜使用法

实验三细菌的形态观察

实验四细菌动力显微镜检查法

一、悬滴法

二、压滴法

三、暗视野显微镜检查法

四、相差显微镜检查法

实验五细菌的染色标本检查法

一、涂片制备及革兰氏染色法

二、抗醛染色法

细菌的生理学

实验六细菌的人工培养

一、常用培养基的制备原则

二、细菌培养的接种方法

三、细菌的生长情况观察

实验七细菌代谢产物观察

一、单糖发酵试验

二、VP试验

三、甲基红（MR）试验

四、证基质试验

五、硫化氧试验

外界因素对细菌的影响

实验八物理因素对细菌的影响

一、温度与细菌生长繁殖的关系

二、紫外线的杀菌作用

买验九化字因素对细菌的影响

皮肤消毒前后的细菌学检查

实验十生物因素对细菌的影响

细菌对抗生素敏感性测定

细菌的遗传与变异

实验十一化学物质对细菌的致突变作用

细菌的感染与免疫

实验十二病原菌的致病性

一、透明质酸酶的扩散作用

二、破伤风杆菌外毒素的毒性作用

三、邕试验

实验十三吞噬细胞的吞噬作用

一、中性粒细胞的吞噬作用

二、单核巨噬细胞的舌噬作用

实验十四体液的杀菌作用

一、正常血清的杀菌作用

二、溶菌酶试验

实验十五病原性球菌

一、病原性球菌形态及染色性

二、病原性球菌的培养特性

三、血浆凝固酶试验

四、抗链球菌溶血毒素"0"试验

实验十六病原性球菌未知标本（脓汁）的检查

实验十七肠道杆菌

一、肠道杆菌的形态及染色性

二、肠道杆菌的培养特性

三、肠道杆菌的生化反应

实验十八变形杆菌

一、形态及染色性

二、迁徒生长情况

三、尿素分解试验

实验十九粪便标本中致病性肠追杆菌的分离与鉴定

实验二十伤寒、副伤寒皿清学检查

肥达氏反应

实验二十一需氧芽胞杆菌

一、需氧芽胞杆菌的生物学特性

二、炭疽杆菌的串珠试验

实验二十二厌氧芽胞杆菌

一、形态及染色特性

二、产气荚膜杆菌"汹涌发酵"试验

三、产气荚摸杆菌动物试验

四、厌氧培养法

实验二十三白喉杆菌

一、白喉杆菌的形态及染色性

二、白喉杆菌的培养特性

三、白喉杆菌平板毒力试验

实验二十四分枝杆菌

一、结核杆菌和麻风杆菌的形态及染色性

二、结核杆菌的培养特性

三、肺结核患者痰标本的直接涂片检查

实验二十五立克次体

一、形态及染色性

二、血清学诊断方法一一外裴氏反应

实验二十六螺旋体

一、形态及染色性

二、暗视野显微镜察钩端蝶旋体的活动力

三、口腔螺旋体涂片与染色

真菌学

实验二十七真菌

一、真菌形态及菌落特点

二、栈部真菌病临蛛标本直接镜检

病毒学

实验二十八、病毒的形态学

实验二十九病毒的培养法

一、动物接种法

二、鸡胚培养法

1.绒毛尿囊膜接种法

2.尿囊腔接种法

3.羊膜腔接种法

三、组织培养法

实验三十腺病毒约分离

实验三十一病毒血清学试验

一、血凝抑制试验

二、反向间接血凝试验

附录一染色液及染色法

（-）吕氏碱性美兰染色液配制及染色法

（二）革兰氏染色液配制

（三）抗酸染色液配制

（四）奈瑟（Neisser）氏染色液配制及染色法

（五）阿尔培脱（Albert）氏尘色液配制及染色方法

（六）冯他那（Fontana）氏渡银染色液配制及染色法

附录二试剂及溶液

（-）甲基红试剂

（二）口引噪（柯氏）试剂

（三）Hank,s溶液

（四）0.5%水解乳蛋白溶液

（五）营养液

（六）维持液

（七）0.25%胰蛋白酶溶液

（八）PH8«6离于强度0.05巴比妥缓冲液

附录三常用培养基制备

（一）肉膏汤培养基

（二）普通琼脂（固体）培养基

（三）血液琼脂培养基

（四）半固体琼脂培养基

（五）蛋自陈水培养基

（六）单糖发酵管培养基

（七）醋酸铅培养基

（A）尿素琼脂培养基

（九）Vogel——Bonner基本培养基（简称E培养基）

（十）完全培养基

（十一）组氨酸软琼脂上层培养基

（十二）S•S琼脂培养基

（十三）中国兰琼脂平板培养基

（十四）半固体双糖培养基

（十五）紫牛乳培养基

（十六）泡肉培养基

（十七）吕氏血清培养基

（十八）亚硫酸钾血琼脂培养基

（十九）Elek蛋白陈培养基

（二十）罗氏培养基

（二十一）苏通氏培养基

（二十二）改良沙保弱氏培养基

（二十三）玉米粉琼脂培养基

附录四真菌小培养法

实验目的和要求

医学微生物学和免疫学实验是医学微生物学的重要组成部分，是医学微生物学和免疫学教学过程中的

重要环节之一，是理论与实验研究的技术基础。

通过实验，加深、巩固对理论内容的理解与记忆；学习、掌握有关医学微生物学的基本操作技术，树

立无菌观念；更重要的是通过实验培养学生实事求是的科学的态度和独立分析问题与解决问题的能力。为

对有关疾病的诊断与防治，对医学微生物学的科学研究工作所必要的实验方法与技术打下一定的基础。特

别是通过实验，使学生熟练地掌握普通光学显微镜、涂片染色、分离接种与稀释方法等基本操作技术。

实验形式分教师示教和学生操作两种。前者主要验证理论，后者可从不同角度进行基本技术训练和反

复练习，掌握基本技能。

为了提高实验课效果，保证实验课质量，要求学生做到：

1.实验前必须做好预习，以了解实验的内容、目的、理论依据、操作方法及注意事项，避免或减少错

误的发生。

2.实验过程中坚持严肃性，严格性与严密性，对操作的实验要在全面理解的基础上，按步骤依次进行

操作，并进行积极地思考；对示教内容要仔细观察并与有关理论密切联系。

3.如实记录，分析结果，得出结论。如结果与理论不符，应尽量分析，探讨起原因以培养训练自己的

思维能力，最后写出实验报告。

实验室规则

实验中所用材料，多具有传染性（如病原微生物、含病原微生物的患者血、尿、便、痰、脓汁及感染

动物等），在实验过程中，必须严肃认真地进行无菌操作，以保证结果准确，防止实验室感染，防止病原

微生物污染环境。必须遵守以下各项。

一、进实验室应穿白大衣，不得将书包、衣物等放在实验台上，不必需的物品勿携入室内。

二、实验室内严禁饮食、吸烟及用嘴舔湿铅笔及瓶签等。

三、保持实验室安静，实验进行时不准随意进出。实验室中物品未经许可不准带出室外。

四、如发生感染或污染等意外时，应立即报告指导老师，进行紧急处理。

L吸入活菌液，应立即吐入容器中消毒，并用1：1000过猛酸甲溶液或3%双氧水漱口，必要时根据

菌类的不同服用适当的抗菌药物。

2.菌液流洒桌面或地面，倾注2——3%来苏儿或0.1%新洁尔灭于污染面上，30分钟后抹去。手上污

染活菌，在上述消毒液中浸泡10——20分钟后，再以肥皂水刷洗。衣服污染时，用上述消毒液浸泡30分

钟后，或高压灭菌后清洗。

五、实验用过的吸管、毛细管及玻片等应立即放入指定的消毒液中，不准在实验台上乱放。接种环用

后应立即于酒精灯火焰上烧灼灭菌。

六、实验完毕，应及时清理实验室，关好门窗水电，用消毒液洗手后离去。

免疫学检测技术

医学免疫学是当代生物科学中一个极为活跃的分支。它不仅是基础医学的重要带头

学科之一，而且对临床各科都产生了重大影响。随着免疫学理论的进步，免疫学检测技术有了显著的改进

和发展，它对探讨临床疾病的发病原理，诊断和防治免疫性疾病，遗传性疾病、肿瘤以及器官移植等具有

广泛的应用价值。

免疫学检测技术分为体液免疫检测和细胞免疫检测两大类。

体液免疫检测

体液免疫检测的基本原理是抗原抗体的特异结合反应。主要包括临床常用的抗原抗体反应和免疫标记

技术。

一、临床常用的抗原抗体反应

临床常用的抗原抗体反应主要指抗原抗体在体外结合，在适当浓度电解质存在的条

件下，直接出现凝集、沉淀、细胞溶解、补体结合等可见反应。因这部分实验以血清作为抗体材料，所以

又可称为血清学反应。

实验一凝集反应

凝集反应是完整的细菌。红细胞等颗粒性抗原与相应抗体在一定条件下出现凝集物的现象。参与反应

的抗原称凝集原，抗体称凝集素。凝集反应包括直接凝集反应、间接凝集反应、间接凝集抑制反应、反向

间接凝集反应、协同凝集试验、抗球蛋白试验等。本实验介绍两种方法。

内容：一、直接凝集反应

二、间接凝集抑制反应

三、ABO血型鉴定法

一、直接凝集反应

直接凝集反应是颗粒性抗原与相应抗体直接结合所出现的凝集现象。基本方法有玻

片法和试管法，本实验介绍玻片法。

玻片凝集试验是一种定性试验，方法简便快速。常用干鉴定菌种、测定人类红细胞的AB（）血型等。

（一）实验目的与原理

练习玻片凝集试验方法。观察凝集现象，判断凝集结果。

抗原与抗体一般均为蛋白质，在中性或磴性溶液中多表现为亲水性，且带有负电荷。抗原抗体结合

后，由于极性基的相互吸引而变为疏水性，易受电解质影响，如有适当的电解质存在，使其失去一部分负

电荷而互相吸引出现肉眼可见的凝块。

（二）实验材料

1、抗体1:10稀释的伤寒杆菌诊断血清与痢疾杆菌诊断血清。

2、抗原:待检病原菌24小时斜面培养物。

3、其它:生理盐水、载玻片、毛细管、接种环等

（三）实验方法

1、取洁净玻片一张，用蜡笔划成三格。标识1、2、3。

2、于I格内滴加1:10伤寒杆菌血清1〜2滴，第二格加1:10痢疾杆菌血清1〜2

滴，第三格滴加1〜2滴生理盐水。

3、用接种环取培养物少许混于第3格中，再取少许培养物分别混于第1、2格中。每次取培养物前接

种环均需火焰灭菌。

4、轻轻摇动玻片，1〜2分钟观察结果。

（四）实验结果

第3格中应是均匀混浊，无凝集出现。

依被检抗原的不同，在第1或第2格中出现块状凝集。如第1格中凝集，被俭物为伤寒杆菌，第2格

凝集则为痢疾杆菌。

二、间接凝集抑制反应

可溶性抗原与抗体结合后不出现凝集。如把可溶性抗原吸附在载体微球上，成为人工免疫微球，再与

抗体结合即出现凝集，此称间接凝集反应。由于载体微球增大了可溶性抗原的反应面积，微球上少量抗原

存在就足以出现肉眼可见的反应。这种反应的敏感性比沉淀反应高得多。

如先使可溶性抗原与抗体充分结合，再加入有关的免疫微球。因抗体已被抗原结合，不再出现免疫微

球的凝集现象。这一试验称间接凝集抑制反应。

（一）试验目的与原理

了解间接凝集抑制反应原理、试验方法与结果判断。

绒毛膜促性腺激素（HCG）为可溶性抗原，在妊娠尿中含量显著增高。如尿中有此抗原存在与相应抗体

（抗一HCG）结合后，加入吸附HCG的免疫微球时，不出现凝集现象，呈均匀乳液，如尿中无HCG存在，

没有抗原与抗体结合，再加入相应的免疫微球时，即出现肉眼可见的凝集（即凝集未被抑制）。

（二）实验材料

1、妊娠诊断血清（抗一一HCG血清）。

2、妊娠诊断抗原（吸附有HCG的免疫微球）。

3、待检尿、正常尿、玻片等。

（三）实验方法

1、取一洁净玻片，用蜡笔划分1、2两格。（图1）

待检尿正常尿

1、阳性结果2、阴性结果

2、加被检尿滴于1格内，加正常尿滴于2格内。

3、每滴尿中各加抗一一HCG血清1滴摇匀或用牙签混匀。

4、再于各滴中加（HCG乳胶抗原。HCG兔疫微球）1滴;混匀，继续摇动2—3分钟。肉眼观察结果。

（四）实验结果

妊娠尿滴呈均匀乳状，无凝集现象（阳性）。

正常尿滴出现明显凝集颗粒（阴性）。

三、ABO血型鉴定法

血型是根据血细胞表面抗原的差异而将人类血液分为若干类型。红细胞、白细胞、血小板各有自己复

杂的抗原系统和血型分类方法，但临床血型主要指红细胞血型而言。

自从1901年Lanlsteiner发现ABO血型系统以来，迄今已发现的人类红细胞血型系统至少有15个，

但在临床输血工作中最重要的还是ABO血型系统。

ABO血型系统根据人类红细胞表面A抗原和B抗原的分布。将人类分为A型、B

型、AB型与O型四个血型。不同血型间进行输血时，可因红细胞表面抗原与血清中天然血型抗体结合产

生凝集反应，在补体存在时，可发生溶血现象。故临床上给病人输血时，必须先鉴定血型，同时需进行交

互配血试验，以复查定型时有无错误或有无亚型存在。

（一）实验目的与原理

熟悉血型鉴定方法及判断结果的理论依据。

ABO血型系统是根据红细胞表面抗原的种类及有无而分为A型、B型、AB型与O

型四个血型。本试验，是依抗原抗体间反应的特异关系，用抗A、抗B两种已知的标准血清（即抗体）分别

与被检血混合。根据红细胞有无凝集判定红细胞表面抗原种类，决定是何种血型。

（二）实验材料

1、标准血清:抗A、抗B标准血清。

2、载玻片、采血针、酒精棉、牙签等。

（三）实验方法

1、取洁净载玻片一张，用蜡笔标记“抗A”、“抗B”两部分。分别加滴抗A、抗B血清。

2、用酒精棉消毒耳垂或手指，用采血针刺破，以另一玻片一端的两角取血两滴。分别滴于"抗A'\"

抗B"血清中、混匀。

3、前后左右摇动玻片，使之充分混合，静止10~15分钟。观察有无凝集。

（四）实验结果

凝集者可见红细胞凝集成块，无凝集者细胞均匀分散。____________________________

抗A血清抗B血清血型____________

0^

+-A型

+B型

++AB型

注：“十”：凝集•“一”：不凝集

实验二沉淀反应

可溶性抗原（如血清蛋白、细菌培养滤过液、细菌浸出液，组织浸出液等）与特异性抗体结合，在适量

电解质的存在下，形成沉淀物，称此反应为沉淀反应。参与沉淀反应的可溶性抗原称为沉淀原，抗体称为

沉淀素。沉淀反应的试验方法有环状法，絮状法和琼脂扩散法三种基本类型。其中琼脂扩散法方法简单，

用途也较广泛，为本实验介绍的重点。

内容：一、双向琼脂扩散

、单向琼指扩散

三、对流免疫电泳

四、火箭电泳

一、双向琼脂扩散

（一）实验目的与原理

了解试验方法，观察判定结果。

利用可溶性抗原与相应抗体在半固体琼脂对应孔中各自向四周进行扩散，如抗原抗体相对应，两者在

比例适当处，就出现肉眼可见的白色沉淀线。•若同时具有几种抗原抗体系统，因各自的扩散速度不同，

可在琼脂中出现多条沉淀线。

（二）实验材料

1、抗体：甲胎蛋白诊断血清。

2、抗原:肝癌病人甲胎蛋白阳性血清或正常人胚胎组织浸出液，待检血清。

3、1%生理盐水琼脂、载玻片、打孔器、毛细管等。

（三）实验方法

1、将1%生理盐水琼脂加热溶化。

2、制备琼脂板:取洁净载片一片，放一水平台上，将溶化的2-5ml琼脂趁热用吸管注于玻片上，使其

自然流成平面，琼脂凝固后用打孔器如图（图2.1）打孔，去掉孔中的琼脂。

O

OO

OOO

O

图2.1双向琼脂扩散模式

3、加样冲央孔中加入甲胎蛋白（AFP）诊断血清，1、4孔加肝癌病人阳性血清，2、3、5、6孔加待

检血清。加血清至满勿外溢。不可有气泡。

4、加样后，将掠脂板放入有一定湿度带盖容器中，置37℃温箱，24小时观察结果。

（四）实验结果（图2.2）

1、1、4孔为阳性对照孔（加已知阳性标本），与中央孔间出现乳白色沉淀线。

2、其余各孔与中央孔如出现沉淀线，且一端与阳性对照沉淀线相吻合者为阳性。证明该份血清含有

甲胎蛋白。如两条沉淀线相交，表明二者抗原性不同，出现的沉淀线另一种抗原扰钵反应，不能判定阳性。

3、如待检孔与中央抗体孔间末出现沉淀线为阳性，证明待检血清中没有甲胎蛋白。

1

O

6O/\02

/O'

5oX；—O3

O

4-

图2—2双向琼脂扩散试验结果

2、6孔：吻合沉淀线（阳性）。

5孔：交叉沉淀线（阴性）。

3孔：无沉淀线（阴性）。

二、单向琼脂扩数

（一）实验目的与原理

了解单扩散试验方法、原理及结果分析。

单扩散实验是一种定量试验方法。先将一定量抗体混合于琼脂中，倾注于平板上。凝固后打孔。加入

待测抗原。如抗原与抗体一致时，抗原向孔四周扩散，与孔周围抗体形成抗原抗体复合物，呈白色沉淀环,

沉淀环直径大小与抗原浓度成正比。如先用不同浓度的标准抗原制成标准曲线，则未知标本中的抗原含量,

即可从标准曲线中求出。本试验主要用于检查标本中各种1g与血清中各种补体成分的测定。

（二）实验材料

1、3%生理盐水琼脂。

2、抗体:免抗人毛Ig抗体血清。

3、抗原:待检人血清、IgG参考抗原。

4、塑料板、吸管、打孔器。

（三）实验方法

1、制备含抗IgG抗体的琼脂板:溶化的3%琼脂、待冷至56℃时吸取1.5ml琼脂与等量适当稀释的抗

IgG抗体混合均匀。倾注于水平放置的塑料板上，制成厚薄均匀的琼脂板。凝固后用打孔器打孔二排，每

排5孔、孔距8—10mm,孔要圆整光滑。

e

。e,⑥■

图3、单向琼脂扩散试验模式

2、加样:用微量加样器加样。

（1）第一排五孔分别加入不同浓度（20、25、50、100、200倍）的参考IgG抗原10、1。

（2）第二排五孔，同法加1:50待检血清103将琼脂板平放于保持一定湿度的带盖容器内，37℃温

箱放置24小时观察结果。

（四）实验结果

标准曲线的绘制及血清标本中IgG含量的测定。

1、以各稀释度标准抗原孔沉淀环直径为横座标，相应孔中IgG含量为纵座标在半对数座标纸上作图，

画出标准曲线。

2、依待检血清标本孔沉淀直径，查标准曲线，将查得的唾G含量乘以标本的稀释倍数，即为血清中

IgG的含量。

三、对流免疫电泳

（一）实验目的与原理

了解琼脂对流免疫电泳的基本方法、原理及特点。

对流免疫电泳是把双扩散与电泳技术结合在一起的方法。

抗原抗体在电场作用下，各向相反的电极移动。因抗原在PH8.6的缓冲液中带负电荷，由阴极向阳极

移动。抗体等电点为PH6~7,在PH8.6环境中带负电荷少，分子又较大，则运动较慢。同时又因电渗作用

等原因使抗体向阴极倒退。于是出现抗原抗体相向移动的情况。如二者相应，在相遇的最适比例处即形成

白色沉淀线。由于抗原抗体在电场中定向移动，从而提高了试验的敏感性，且沉淀线出现较快，可在一小

时内出现结果。

（二）实验材料

1、抗原:甲胎蛋白阴、阳性血清。

2、抗体:甲胎蛋白诊断血清。

3、缓冲液、PH8.6,离子强度0.025——0.05巴比妥缓冲液。

4、1%缓冲琼脂（精制琼脂粉）。

5、电泳仪、载玻片、毛细管等。

（三）实验方法

1、制备琼脂板:将1%缓冲琼脂溶化。吸3ml琼脂倾注于平放的洁净载片上。凝固后如图3孔，孔径

3mm,抗原抗体孔间距5mm。

十

1004-

2OO5

3006

图3、对流免疫电泳模式

2、力口样:1、2、3孔加甲胎蛋白诊断血清，4孔加阳性对照血清，5、6号孔均加待检血清。

3、将琼脂板置于电泳槽架上，抗原孔置阴极端，抗体孔置阳极端。琼脂板两端用双层滤纸与缓冲液

相连，接通电源，控制电流在3〜4mlA/Cm宽（载片宽2.5Cm,应控制电流在10mA）。电压6—10V/cm长，

通电1〜2小时；

4、关闭电源、取出琼脂板，观察结果。

（四）实验结果

1、1、4孔间应出现白色沉淀线（阳性对照）。

2、2、5孔间出现白色沉淀线（待检血清阳性）。

3、3、6孔间无沉淀线出现（待检血清阴性）。

四、火箭电泳

（一）实验目的和原理

了解火箭电泳试验方法。原理与结果分析。

火箭电泳是把单扩散和电泳结合在一起的方法。抗原在含定量抗体的琼脂中泳动，二者比例合适时，

在短时间内形成火箭样或锥状的白色沉淀线，沉淀峰的高低与抗原的浓度成正比。

（二）实验材料

1、抗原。

2、抗体。

3、2%缓冲琼脂。

4、0.05MPH8.6巴比妥缓冲液。

5、电泳仪、载玻片、打孔器等。

（三）实验方法

1、将2%缓冲琼脂加热溶解，保温于56c水浴中。

2、用0.05MPH8.6巴比妥液将抗体稀释。

3、制板:将二液等量混合，取3ml倾注于平放的载片上。待凝，在载片近端1.5cm处打孔一排共3孔。

孔距4mm。孔径3mm。（图4）

一

图4火箭电泳示意图

4、用微量加样器分别吸三种不同稀释度的抗原液各加lOuEo

5、琼脂板置于电泳槽架上，抗原孔在阴极端。用两层滤纸与缓冲液连接。接通电源，电流ImA/mm

宽或6V/cm长。通电4~5小时。

6、关闭电源，取出琼脂板、观察结果。

（四）实验结果

三孔均出现沉淀峰，随抗原浓度增大，沉淀峰也随之升高。

实验三补体结合试验

除凝集反应、沉淀反应外，常用的抗原抗体反应还有补体结合试验、中和试验、溶血空斑试验等。本实

验介绍补体结合试验。

一、实验目的与原理

了解补体结合试验方法及结果分析。

补体结合试验是一种有补体参与，并以绵羊红细胞及溶血素作为指示系统的抗原抗

体反应。如被检血中有相应抗体存在，则加入相应抗原与补体后。由于抗原抗体形成复合物，可使补体与

之结合，溶液中即无游离补体存在。但由于这种结合肉眼不能区别，故需加入指示系统（绵羊红细胞及其溶

血素）。如补体已为试验系统抗原抗体复合物所固定，加入指示系统后，因无补体与之结合，则不发生溶血

（溶血与否、肉眼易于区别），是为补体结合试验阳性，表明抗原与抗体相对应。如出现溶血。为补体结合

试验阴性。表明试验系统中抗原与抗体不相应。补体末被固定，加入指示系统后。补体与之结合。从而发

生溶血反应。

二、实验材料

1、抗原:甲型（或乙型）副伤寒杆菌菌液、2%绵羊红细胞悬液。

2、抗体:甲型（或乙型）副伤寒杆菌诊断血清。溶血素（2个单位/0.25ml）。

3、补体:琢鼠血清（2个实用单位/0.25ml）

4、其它:生理盐水、小试管、吸管等。

三、实验方法：

1、取5只小试管、排于试管架上并注明管号。

2、第1管加生理盐水0.4ml,再用吸管取已灭活（56℃加温30分钟）的抗体血清、hnl（或被检血清）加

入第一管，吸吹三次使之充分混匀，然后吸出0。25ml放入第2管，两管中的血清均为1:5稀释。

3、按下表所示顺序进行操作。

试管号12345

试管种类试验管血清对照抗原对照溶血素对照羊红细胞对照

1：5血清0.250.25______

抗原0.25__0.25____

补体0.50.50.50.5__

生理盐水0.250.250.51.25

摇匀37℃水浴30分钟

溶血清0.250.250.250.25__

2%羊红细胞0.250.250.250.250.25

摇匀37℃水浴15分钟

结果+++

注：“一”无溶血+溶血

四、实验结果

先观察有无溶血现象，各对照管结果是否正确。

溶血现象:红细胞溶解，混浊液变为红色透明液体;不溶血现象:红细胞未溶解、混浊液不变。

第2、3、4管因缺乏相应待检抗原抗体复合物，故应完全溶血，第5管因仅有羊红细胞和生理盐水故

不应溶血。以上均为对照管。

第1管不溶血者为补体结合反应阳性。

二、免疫标记技术

免疫标记技术是用易于识别、检测的标记物如放射性同位素、荧光素、酶等标记已知的抗原或抗体进

行的抗原抗体反应，用以检测体内超微量的抗体或抗原。

免疫标记技术保持了抗原抗体反应高度的特异性。当标记的抗体或抗原与待测的相应抗原或抗体反应

后，可以不必测定抗原抗体复合物本身，而测定易于识别和检测的抗原抗体复合物中的标记物。通过标记

物的放大作用，进一步提高了抗原抗体反应的敏感性，使检测方法的敏感性达到ng〜pg/ml水平较常规的血

清学方法至少提高敏感性达两个数最级以上。

临床常用的三大标记技求是:酶联免疫吸附试验、荧光抗体技术和放射免疫测定。

实验四荧光抗体技术

荥光抗体技术即免疫荧光技术，是用荧光素与抗体结合成荧光抗体进行的抗原抗体

反应，是将抗原抗体反应的特异性，荧光素的敏感性，显微镜检查法结合起来的一种免疫学检测方法.

荧光抗体技术的基本方法有直接法，间接法、补体法。本实验介绍间接法。

内容：荧光抗体技术一一间接法

一、实验目的与原理

了解实验原理、方法及观察结果。

荧光素具有能和抗体蛋白分子结合并保持抗体活性而仍能和相应抗原形成免疫复合

物的特性，并且借助于荧光显微镜，通过观察荧光素而检测相应抗原。

二、实验材料

（一）器材1、荧光显微镜。

2、37c温箱。

3、玻片、吸管等。

（二）试剂：

1、抗原。

2、抗体:第一抗体，末标记荧光素的睡IgG。第二抗体:荧光抗体，荧光素标记的抗IgG抗体。

3、其它四PH7.4的FBS缓冲液、甘油缓冲液、丙酮等。

三、实验方法

1、制备含待检抗原的玻片，将待检抗原标本置丙酮中固定10分钟，用PBS缓冲液冲洗。

2、与第一抗体结合：在玻片上滴加第荧光抗体1〜2滴，置湿盒37℃保温30分钟，然后以PBS轻轻

洗涤3次，凉干。

3、与荧光抗体作用:在玻片上滴加荧光抗体1一2滴;置湿盒37C保温30分钟，PBS洗涤后凉干。

4、封片:在玻片的涂面上加盖玻片，四周滴甘油缓冲液1〜2滴封片。

5、立即将标本置于荧光显微镜下观察。

6、对照:同时设阳性与阴性对照，以排除特异性荧光染色攻游离荧光素的干扰。

四、实验结果

根据特异荧光强度判走结果，用加号法表示•标准如下：

(-)无荧光。

(±)极弱的可疑荧光。

(+)荧光较弱，但清晰可见。

(++)荧光明亮。

(+++—++-H-)荧光闪亮，且范围广。

实验五放射免疫测定

放射免疫测定是60年代初期由YaloW和Barson创立的一种体外超微量定量分析方法。它将具有高灵

敏度的放射性核素示踪技术与高度特异性的抗原抗体反应结合起来，具有灵敏度高、特异性强、重复性好、

标本用量小、操作简便等优点，应用范围极广，几乎可以应用于一切具有活性物质的测定•目前普遍应用

于体液中微量蛋白质、激素:药物等的测定。

内容：放射免疫测定一一双抗体法

一、实验目的与原理

了解实验原理及实验方法。

放射免疫测定的基本原理，是标记抗原Ag*和未标记抗原(Ag)对特异性抗体(Ab)的竞争性结合

抑制反应。其反应以下式表示：

Agx+Abr^Ag^—Ab

+

Ag

Ag-Ab

在以上反应式中，当标记抗原(Ag*)与抗体(Ab)的量保持桓定时，则标记抗原抗体复合物(Ag*-Ab)

的形成受未标记抗原(Ag)的制约。如样品中的未标记抗原含量高，则未标记抗原对特异性抗体的竞争能力

强，未标记抗原抗体复合物的量就增多，标记抗原抗体复合物的量就相对减少。如样品中未标记抗原含量

低•则标记抗原抗体复合物的量就相对增加。标记抗原抗体复合物的形成量与末标识抗原的含量呈一定的

逆相关函数关系。

实际工作中，通常先以各种已知浓度的禾标记抗原和一定量的标记抗原及其抗体作用，根据测得的各

种末标记抗原标准浓度下标记抗原抗体复合物的放射性结合率•绘制成竞争抑制标准曲线。检测样品时，

根据被测抗原的放射性结合率♦即可在竞争抑制标准曲线上查出相应的该抗原含量，

图4火箭电泳示意图

图5竞争抑制标准曲线示意图

例如用放射免疫测定（双抗体法）检测乙型肝炎表面抗原。利用.i-HBsAg与乙型肝炎患者血清中

HBSAg对特异性抗体的竞争反应,形成抗原抗体复合物,加入第二抗体，复合物板沉淀，而游离的⑵HBsAg

留在上清液中，离心去取上清液，测定沉淀物的放射性•用以表示血清中HBsAg的浓度。

二、实验材料

（一）器材:

1、r计数器。

2、塑料试管、吸管等。

3、37℃温箱，离心机•

（二）1试剂（您J标记试剂盒）

1、11玉•Ag标记液:缓冲液稀释成，00011♦,pm扣,1讨.

2、干燥抗HBsAg血清:以PH7.410ml0.05mol/LPBS溶解。

3、第二抗体:羊抗马IgG。

4、稀释液，用蒸憎水稀释至100mL

5、参考皿清:冻干品，以0.5ml蒸储水溶解。

三、实验方法

1、取6只塑料试管，排于试管架上并注明管号。

2、按下表所示顺序进行操作。

试剂1~2（阴性对照管）3~4（阳性对照管）5〜6（样品管）

阴性对照血清0.05ml一—

阳性对照血清—0.05ml—

待测血清一一0.05ml

稀释液0.05ml0.05ml0.05ml

抗血清0.1ml0.1ml0.1ml

,25I—HBsAg0.1ml0.1ml0.1ml

充分混勿后置37℃1小时

第二抗体

0.1ml0.1ml0.1ml

（羊抗马IgG）

充分混匀，置37℃30分钟后，测各管总叩m（T）»

离心（3000r/min）15分钟，倾上清液，测各管沉淀epm（B）

四、实验结果

结合率（％）=0x100%

T

比值—阳性对照管结合率

一_测定管结合率

比值>1.5为阳性，V1.5为阴性。

实验六酶联免疫吸附实验

免疫酶技术是免疫标记技术的一种，是把抗原体反应和酶的高效催化作用原理有机的结合起来，具有

免疫荧光技术和放射免疫测定的优点，克服了上述二种方法的缺点的一种新的免疫测定方法。酶标试剂制

备容易、稳定、有效期长，敏感性接近放射免疫试验。可肉眼观察也可借助仪器作定量测定。所得结果比

较客观。目前，酶标记技术广泛地应用于微生物学、寄生虫学等基础免疫试验及临床免疫实验中。其中，

尤以1971年Engvall和VanWeeman建立的醐联免吸附试验（ELISA）最为常用，ELISA有间接法（测抗

体）、双抗体夹心法（测大?抗原）及竞争法（测小分子抗原）三种，以前二塔较为常用。

内容：酶联免疫吸附试验一一双抗体夹心法

一、实验目的与原理

了解实验方法原理及结果观察与判断。

这是已知抗体测定未知抗原的一种方法。将纯化的抗体结合到固相载体上。加待检血清（欲测抗原）然

后加辣根过氧比物酶（HRP）•使之与被固相抗体结合的待检抗原体起反应，最后结合在免疫复合物上的

酶遇到相应底物时，使其氧化，从而产生颜色。颜色的深浅与待检血清中抗原量成正比•

二、实验材料

（-）器材：

1、酶联免疫检测仪。

2,37℃温箱。

3、40孔聚苯乙烯板。

4、微量加液器（50ul>lOOul）,

（二）试剂：

1、0.05MPH9.6碳酸缓冲液。

2、稀释缓冲液（KCL0.2g,KH2PO4.H2O2.9g,NaC118g,蒸储水稀释至1000mL使用时，加10%免

血清。

3、洗涤缓冲液（同稀释缓冲液，但以0.05%Tween-20代替10%兔血清）

4、底物溶液（PH5.0磷酸盐、柠博酸盐缓冲液：将0.2MNa2Hpe）425.3ml和01M24.7ml柠檬酸混合后，

加蒸馆水至1000ml,临用前，上述溶液10ml加邻苯二胺4mg,溶解后加入15nl30%H2O2o

5、2NH2sO4。

6、抗原:HBsAg阻性对照血清及阴性对照血清。

7、抗体，抗一HBs与醐标抗一HBs。

三、实验方法

1、包被：用PH9.60.05M碳酸缓冲液将抗-HBs稀释至蛋自量为50ug/mI。在聚苯乙烯板的反应孔

中加色0.1ml4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次、每次3分钟。

2、加样：加待检样品0.1ml于上述己包被的反应孔中，37c2小时。保温后如上洗涤三次。同时做空

白对照（空白孔中不加血清），阴性对照（孔中加正常人血清）和阳性对照（孔中加病人阳性血清）。

3、加酶标抗体，各孔中加入新配制醯标记抗体一HBs（一般1：2000到1：8000稀释0.1mL37℃保温2

小时，保温后洗涤3次。

4、加底物显色：各反应孔中加底物溶液0.1ml,37℃保温20分钟。

5、终止反应：各反应孔中加入2NH2so4。0.5mL

四、实验结果

肉眼观察：

空白对照与阴性对照孔为无色或接近无色。

阳性对照孔呈深红棕色。

待检样品孔呈色反应即为阳性，

酶联检测仪读取的OD值，可直接作为EL1SA结果报告。

细胞免疫检测

细胞免疫检测的主要目的，是对患者的免疫功能进行评价，以辅助疾病的诊断，疗效的判断及对疾病

的预后进行分析。

细胞免疫检测的王要项目包括淋巴细胞数量和功能的测定。

实验七T细胞计数

体外测走人外周血中T淋巴细胞数量的方法有多种，以玫理花环试验最为简易常用，T淋巴细胞数量的

变化与机体的细胞免疫叨黑状态有一走关系。临床上多用于产些疾病的诊断及疗效韵观察。

内容：一、E玫瑰花结试验

二、Ea玫瑰花结试验

一、E攻瑰花结试验

（-）实验目的与原理

了解E玫瑰花结试验方法、观察花结形成现象。

人周围血液中T淋巴细胞表面有绵羊红细胞受体，与羊红细泡相遇时.，在其周围形

成花环详细胞团，凡能结合三个以上绵羊红细胞者称为E攻瑰花结形成细胞。正常人的

花环形成率为50-70%,大致可以代表周围血中T细胞的百分数。

（二）实验材料

1、淋巴细胞分层液（Ficou）。

2、1%绵羊红细胞。

3、肝素抗凝人血。

4、无钙镁Hanks液。

5、水平离心机。

6、0.8%戊二醛。

7,37℃水浴箱。

8、显微镜。

9、其他。

（三）实验方法

1、取肝素抗凝血卜2ml,用分层液分出淋巴细胞并洗涤，用Hanks液调整细胞浓度为2—2.5

2、取小试管加入巴1ml淋巴细胞悬液及1%羊红细胞0.1,nl«混匀•置37C水浴箱5分钟。

3、800〜1000r/min低速离心5分钟,放4℃冰箱2小时。

4、轻轻旋转试管使团块混匀，加2滴0.8%戈二醛液，摇匀，室温静置10分钟，使F花环固定。

5、取悬液一滴放于载玻片上，将稀释的瑞氏染液加入玻片上染色3分钟。

6、弃去染液，待干后油镜观察，计数200个淋巴细胞中形成花环的细胞效，算出百分率。

（四）实验结果

1、淋巴细胞染成深兰色，羊红细胞染成淡红色。

2、每个淋巴拙胞上粘附三个以上羊红细胞者即为玫瑰花环形成细胞，

二、En攻瑰花结形成试验（活性E花环形成试验）

（一）实验目的与原理

了解Ea花环形成试验方法、观察现象。

T淋巴细胞中有不同的异质性亚群，他们对羊红细胞有不同程度的亲合力，形成活性E花环的细胞称

活性花环形成细胞，它可能是T淋巴细胞中对羊红细胞有高度亲合力的一个亚群，在室温中几分钟即可形

成玫瑰花环。活性E花环形成细胞数可能反映机体的细胞免疫水平。凡能结合三个以上羊红细胞者称为

Ea玫瑰花环（活性玫瑰花环）。

（二）、实验材料（同E玫瑰花结试验）

（三）、实验方法

1、制备好的淋巴细胞0.1ml（含30万个淋巴细胞）置于小试管中。再各加入0.1ml绵

兰红细胞（含600万个羊红细胞）。再各加入0.05ml小牛血清（最好是五头小牛血清混合后并经羊红细胞吸

收过）。

2、混匀后,立即800混000r/min离心5分钟。

3、离心后，立即将管拿在手中，慢慢旋转、约1分钟左右将下沉的细胞摇匀，但不致使花环散开。

4、向小管中加新配制的0.8%戊二醛溶液0.1ml,轻轻摇匀，4℃冰箱中固定15分钟。

5、取洁净玻片二张，将固定好的细胞悬液全部吸出，轮流滴在二张玻片上、至滴完为止。用毛细管

将悬液铺干、待干。

6、用稀释的瑞氏染液染3分钟，弃去染液，高倍镜观察，如淋巴细胞染或深兰色，SRBC呈淡红色时，

用水冲去染液，待干后油镜计数。二片共汁400个淋巴细胞，算出形成花环细胞占全细胞数的百分率。

（四）实验结果

淋巴细胞呈深兰色、SRBC呈淡红色。每个淋巴细胞上粘附3个SRBC以上，即为攻瑰花环。但SRBC

必须与淋巴细胞膜附着。

实验八淋巴细胞转化试验

T淋巴细胞受到特异性抗原或非特异性抗原（PHA、PWM和ConA）刺激均能使细

胞发生转化。T淋巴细胞转化率的高低可反映人体细胞免疫功能水平，常被作为细胞免疫功能指标之一。

淋巴细胞转化试验可从周围血中分离出淋巴细胞，也可采用全血试验。试验方法主要有形态学方法和3H

胸腺嗓噬核甘酸dH-TdR）修入法二种。前法简单易行，不需特殊设备，本试验介绍这种方法。

一、实验目的与原理

了解淋巴细胞转化试验方法、原理及其临床意义。

T淋巴细胞有植物血凝素（PHA）受体，在体外受刺激后，可发生形态改变而转化为淋巴母细胞。用姬姆

萨染色后，计算200个淋巴细胞中转化为母细胞的细胞数（包括过渡型、母细胞和分裂相淋巴细胞），依

转比的百分率判定T淋巴细胞的功能。

二、实验材料

1、正常人淋巴细胞（用分层液分出）。

2、培养液：0.5%水解乳蛋白Hanks氏液（含20%小牛血清和青霉素100单位/ml、链霉素100微克/ml）。

用5.6%NaHCC）3调整PH至7.2〜7.4。

3、植物血凝素（PHA）。

4、青霉素小瓶、吸管、载玻片、姬姆萨染液等。

三、实验方法

1、制备细胞悬液:用培养液将淋巴细胞稀释成2Xl（）6/mi,细胞悬液。

2、分装：向两个小瓶中各加2ml,细胞悬液,一瓶加PHA0.1mI1（100单位），另瓶不加作对照。

3、370c培养72小时。离心沉淀，用Hanks液洗两次。

4、用沉淀推成血片，加姬姆萨染液栗色，镜下观察计数200个以上淋巴细胞，算出转化率。

四、实验结果

对照管转化率1%左右，加PHA之管转化主约为70%左右。

1、成热的淋巴细胞:与外周血中小淋巴细胞形态一致、直径6-8微米，核染色质网

密、无核仁、胞浆略大于核贡轻度嗜碱性。

2、过度型淋巴细胞:直径10—20微米核质密，但有明显核仁。

3、淋巴母细胞，细胞增大，形态不规则，直径20〜30微米，核也增大，染色质网纤细有核仁1〜2个,

胞浆扩大，强嗜碱性可见数个空泡及颗粒。

4、网状细胞样母细胞：细胞增，形态不规则，核淡染有1一2个大小不规则的核仁，胞浆扩大、含

空泡，嗜碱性不强有透明感。

实验九移动抑制试验

正常淋巴细胞受相应抗原或非特异性刺激物作用时，能产生移动抑制因子(MIF)可用巨噬细胞或白细

胞作为实验系统中的指示细胞而被检测出米。前者称为巨噬细胞移动抑制试验，后者称为日细胞移动抑制

试验，是测定迟发型变态支应的二种常用的体外试验，也是检测细胞免辞功能的一个指标。

内容：白细胞移动抑制试验

一、实验目的与原理

了解试验方法、结果测定及其意义

白细咆移动抑制试验是一种恃异性的体外。免疫试验。体内玫敏淋巴细胞在相应抗原作用下古生多种

淋巴因子，其中