微生物系列专题02样本采集与实验流程

®样本采集与实验流程解螺旋

|

知识金牌解

螺

旋 | 陪

伴

医

生

科

研

成

长知

识

金

牌01微生物组研究实验流程02微生物组研究样本采集方法03常见问题CONTENTS课

程

目

录微生物组研究样本采集方法01知

识

金

牌微生物组研究样本采集口腔呼吸道皮肤消化道生殖道牙釉质舌腮

上颚扁桃体牙龈肘窝上臂趾缝鼻腔咽部气管肺部人类/鼠类粪便鼠类肠道组织

鼠类肠道内容物阴道解

螺

旋|陪

伴

医

生

科

研

成

长子宫羊水口腔样本取样 知

识

金

牌解

螺

旋|陪

伴

医

生

科

研

成

长取样前注意事项了解测试者的口腔病史，记录相应信息；抗生素对于菌群的影响较大，故要求受试者取样前3个月内未使用过抗生素；若有，请详细记录使用时间及抗生素种类；取样当天与平时相比，身体须无特殊不适症状；取样前1

hr，请勿进食、饮水、吸烟或嚼口香糖，用饮用水将口腔内的杂物洗漱干净口腔样本取样-唾液 知

识

金

牌将唾液保持在口中持续至少1

min，吐入灭菌离心管中，重复多次以收集唾液2-5

mL

（不含泡沫部分）；液氮速冻，自封袋封存，-80℃保存，干冰寄送；或采用商业化唾液取样管取样解

螺

旋|陪

伴

医

生

科

研

成

长知

识

金

牌舌背部：刮取舌中心1

cm2

的部位，约5s；上颚：刮取整个硬颚，约10

s；颊粘膜：刮取左侧和右侧的整个口腔粘膜区，每侧约10

s，避免接触到牙齿；角质化的牙龈：刮取颚前方的牙龈，约10

s；腭扁桃体：分别刮取左侧和右侧的腭扁桃体5

s；咽喉：慢慢地将拭子放入咽部后方，约5

s，注意不要刮到扁桃体；（由于咽反射咽喉部位样本较难收集，建议取完别的部位后再取）龈上牙菌斑：

记录牙菌斑取自哪颗牙齿，如臼齿，前臼齿，门牙。

先干燥取样的部位，用棉拭子刮取尽可能多的牙菌斑；龈下牙菌斑：与龈上牙菌斑处理方式相同，需要注意要清除残留的龈上牙菌斑，并注意要丢弃有出血的样本取样后剪下棉拭子头（2-3个）放入灭菌冻存管，液氮速冻，-80℃保存，干冰寄送；注意：棉拭子可用无菌生理盐水或磷酸盐缓冲液润湿，以增加微生物附着率口腔样本取样-口腔组织解

螺

旋|陪

伴

医

生

科

研

成

长皮肤样本取样 知

识

金

牌采样前注意事项了解测试者的皮肤病史，详细记录相应信息；抗生素菌群的影响较大，故要求受试者取样前3个月内未使用过抗生素；若有，请注明使用时间及种类；取样前7天，脸部，头皮，脖子，胳膊，前臂或者手未使用过抗生素或者萜类物质；取样前24

hrs不能洗澡、不能使用润肤乳及抗菌活性的肥皂等，取样前7天未使用抗菌成分的沐浴用品取样方法将灭菌棉拭子在ST溶液（0.15

MNaCl

加有0.1%

Tween20）或灭菌生理盐水中浸湿，在目标皮肤区域擦拭30

s；取样后将棉拭子头（2-3个）剪下放入灭菌冻存管，液氮速冻，-80℃保存，干冰寄送Doi：10.1038/ismej.2012.81解

螺

旋|陪

伴

医

生

科

研

成

长呼吸道样本取样 知

识

金

牌咽部棉拭子取样用灭菌棉拭子在受试者咽后壁旋转1周，注意在取样时避免触及舌、口颊黏膜和唾液鼻腔鼻咽拭子取样尽可能使明亮的光线照进鼻腔，将洁净的鼻咽拭子轻轻插入鼻道内鼻腭处，停留片刻后缓慢转动退出；拭子头浸入采样液中，尾部弃去气管镜防污染采样刷（PSB）取样口咽部麻醉后将支气管镜引入到受试者取样部位（声带，支气管等），PSB经气管镜刷检口插入刷取分泌物，气管镜取出后刷检分泌物送检，操作过程中避免负压吸引，放置气管镜管道污染肺泡灌洗液（BAL）取样口咽部麻醉后将支气管镜通过口或鼻引入到受试者取样部位（声带，支气管等），滴注50-150

mL无菌生理盐水进行标本的抽取，灌洗液通过过滤或离心的方式富集；富集后的样品液氮速冻，-80℃保存，干冰寄送解

螺

旋|陪

伴

医

生

科

研

成

长生殖道样本取样 知

识

金

牌解

螺

旋|陪

伴

医

生

科

研

成

长取样前注意事项了解测试者妇科病史，详细记录相应信息（如pH值等），记录测试者12个月内避孕药的使用情况；采血进行HIV、HSV检查；在取样前6个月内不能使用抗生素、皮质类固醇、细胞激素、氨蝶呤或免疫抑制细胞毒性药物及抗生素为主要成份的食物、大剂量的益生菌产品（≥108

cfu/天）、激素类阴道环等；女性测试者必须在非生理期取样；尿妊娠试验结果为阴性（除非研究目的如此）；取样前七天未使用生殖道相关药物（包括抗真菌药物）；取样前48

hrs尽量避免使用加氯消毒的游泳池或浴盆，女性测试者避免性行为，避免使用避孕药、避孕隔膜、宫颈罩、避孕海绵、栓剂、女性喷雾剂等取样方法据实验研究需求，用灭菌棉拭子从目标区域采样；棉拭子擦拭5次后，将棉拭子头（2-3个）置入含有无菌磷酸盐缓冲液的冻存管中；液氮速冻；样品置于-80℃保存，干冰寄送Doi：10.1038/s41467-017-00901-0知

识

金

牌消化道样本取样解

螺

旋|陪

伴

医

生

科

研

成

长取样前注意事项取样前3个月内未使用抗生素；若有，请注明使用时间及种类；身体状态良好，与平时相比无特殊不适症状；取样前一周保持日常饮食习惯，饮食不要大幅变化；生理期女性不可取样取样注意事项尽量在同一时间取样（考虑哺乳动物肠道微生物的时间节律性变化）；详细记录取样样品的相应信息（样本名，采样时间等）；避免尿液污染粪便知

识

金

牌消化道样本取样-粪便用采样管无菌勺取粪便中段未接触空气、地面的部分约3-5

g；将所取的粪便和勺子一同放入收集管中，盖紧盖子（有保护液的情况下需摇晃管子，使粪便和保护液充分混匀）；将采样管统一按采样套装要求放置，3天内，干冰寄送解

螺

旋|陪

伴

医

生

科

研

成

长知

识

金

牌消化道样本取样解

螺

旋|陪

伴

医

生

科

研

成

长肠道灌洗液取样收集肠道灌洗液，过0.2

μm滤膜，或者12000

g离心，弃上清保留沉淀直肠棉拭子样本取样粪便不易获得时，肥皂、水、70%的酒精清洁肛门周围，将无菌拭子用生理盐水湿润后插入肛门4~5

cm（幼儿2~3

cm），肛门括约肌处轻柔的旋转，于肛门隐窝处取样，拭子上明显见到粪便，然后插入无菌管（或将棉拭子头部剪落入无菌离心管中，每个样本提供3-5个棉拭子）；-80℃保存，24

hrs内干冰运输到实验室知

识

金

牌鼠类样本取样解

螺

旋|陪

伴

医

生

科

研

成

长取样注意事项采用无菌器械进行无菌操作；不同样品采集时注意更换采样器具；详细记录样品名称、样本来源、取样时间等基本信息；因鼠类取食粪便的习性，不同处理间的鼠需避免同笼喂养；尽量于同一时段进行采样，避免肠道微生物组成在不同时间内的变化；自然排便取样时，鼠笼需为高压灭菌处理的微隔离器空笼或无菌笼；可以采用应激排便方法收集粪便；样品尽量进行分装，保存时避免出现反复冻融知

识

金

牌鼠类样本取样-粪便代谢笼收集粪便代谢笼：粪尿分离装置，采样应激性排便采集固定小鼠，将其尾部提起，手指轻轻按压小鼠下腹部；收集新鲜粪便于对应编号的无菌离心管中，每管分装2-3颗自然排便采集小鼠置于无菌的笼子中（无需垫料）；自然排便，取样；封装，

-80℃冷冻，干冰寄送解

螺

旋|陪

伴

医

生

科

研

成

长知

识

金

牌鼠类样本取样解

螺

旋|陪

伴

医

生

科

研

成

长肠道内容物样本采集在实验对象死亡后，用无菌解剖刀，在无菌状态下取出整个肠道，切取所需肠段的内容物；用无菌手术刀挖取内容物，立即放在冰上进行分装并标记；用灭菌离心管分装，单个样本取样量：0.2-0.5g/管；分装好后，若当天提取DNA，可以先放4°C，长期存放需先迅速放入液氮中，-80°C保存；在采样允许的情况下，尽量多采集样品，每个样本取多管备份肠道组织样本采集组织样本用无菌磷酸盐缓冲液轻轻清洗，直到没有内容物流出；用无菌的显微镜玻片刮取附着在表面的组织；长期存放需先迅速放入液氮中，之后立即放入-80°C保存微生物组研究实验流程02知

识

金

牌微生物组研究实验流程样本收集核酸提取文库构建高通量测序生物信息分析解

螺

旋|陪

伴

医

生

科

研

成

长知

识

金

牌核酸提取QiagenMOBIOMP

BiomedicalsPromega解

螺

旋|陪

伴

医

生

科

研

成

长…

…尽可能从样品中获得足够高质、量的包含微生物群落真实信息的核酸；多数提取流程基于化学和机械细胞裂解方法，使用缓冲液从固定基质中洗脱出DNA或RNA商业化核酸提取试剂盒Doi:10.1038/nrgastro.2017.97解

螺

旋 | 陪

伴

医

生

科

研

成

长知

识

金

牌文库构建-微生物多样性测序Miseq平台知

识

金

牌文库构建-宏基因组测序Hiseq平台解

螺

旋|陪

伴

医

生

科

研

成

长知

识

金

牌文库构建-宏转录组链特异性文库Hiseq平台解

螺

旋|陪

伴

医

生

科

研

成

长解

螺

旋

|陪

伴

医

生

科

研

成

长知

识

金

牌文库构建-PacBio

SMRT测序DNA片段化浓度测定DNA末端修复DNA损伤修复Adapters连接引物退火模板纯化聚合酶结合测序RSII平台Sequel平台知

识

金

牌微生物组芯片实验流程靶标制备预设计芯片核酸样品与芯片杂交自动化

微生物分析Gene

Titan

MC仪器自动化、无需人工干预的芯片处理系统解

螺

旋 | 陪

伴

医

生

科

研

成

长DNA抽提与质检DNA样本线性扩增沉淀、收集目标片段芯片洗染扫描24或96芯片可选自动和手动方案Axiom

MiDAS

自动化微生物分析软件常见问题03解

螺

旋 | 陪

伴

医

生

科

研

成

长Q&A 知

识

金

牌Q：采样时如何设置生物学重复？A：生物学重复的设置能够消除组内误差；降低背景差异，增加结果可靠性；用于检测、排除离群样本。一般，鼠类粪便样本，建议5个以上生物学重复；临床粪便等样品，由于个体特异性，建议30个以上生物学重复Q：样本送样要求？A：临床样本

粪便

≥

2g；棉拭子样本

≥

2

个Q：样本保存、寄送注意事项？A：样本分装、-80℃保存；寄送时样本分装离心管、封口膜封口；详细标记样品编号；足量干冰寄送微生物多样性宏基因组宏转录组微生物芯片总量>

200

ng>

3

μg