《烟用添加剂中硫脲的测定 高效液相色谱法实验报告》

《烟用添加剂中硫脲的测定高效液相色谱法》实验报告云南烟草科学研究院二○一

目录TOC\o"1-4"\h\z\u1前言 41.1硫脲简介 41.2理化性质 41.3检测方法综述 41.3.1分光光度法 41.3.2色谱法 51.3.3其它类型的检测方法 51.4小结 62标准适用范围 63原理 64试验方法 64.1仪器 64.2试剂与材料 64.3试样前处理 74.4高效液相色谱条件 74.5标准曲线制作 84.6试样测定结果 95结果与讨论 95.1色谱条件的选择 95.1.1检测器及波长的选择 95.1.2色谱柱的选择 105.1.3流动相的选择 115.1.4其它色谱条件的选择 145.2前处理步骤的选择及优化 155.2.1空白试验 155.2.2萃取步骤的优化 165.2.3待测样溶剂环境调节 195.2.4其它前处理条件的选择 205.3方法评价 215.3.1检出限和定量限 215.3.2精密度 215.3.3重复性 225.3.4储备液稳定性 235.3.5试样稳定性 245.3.6试样加标回收率 255.3.7比对试验结果 265.3.8试样测定 27参考文献 28附件一方法的检出限及定量限 30附件二试样中对乙氧基苯脲定性确认方法 331前言1.1硫脲简介硫脲（thiourea），别名：硫代尿素，主要用于有机合成，医药上用作生产药物的中间体,橡胶工业上用作硫化促进剂,采矿上用作浮选剂，还用作纺织品化学漂白剂、纸张处理剂，印染助剂，石油化工助剂,在冶金、电镀、农药等行业也有应用。早期曾一度作为防腐剂，广泛用于各类需要漂白、保鲜防腐的食品。向食品中加入硫脲可阻止褐变，表观光亮，略带半透明。据报导，国内东南沿海有用硫脲增白、增筋面条，这种面条表观光亮、略带半透明，煮熟后爽滑有弹性，口感不错。但是，硫脲一旦被人体摄入后，会导致多种危害，这些危害包括：抑制甲状腺和造血器官的机能，引起中枢神经麻痹及呼吸和心脏功能降低等，甚至导致死亡。IARC致癌性评价：动物阳性反应。基于上述对人体的危害性，我国已不允许其作为食品添加剂使用。1.2理化性质硫脲分子式为CH4N2S，分子量为76.12，CAS号为62-56-6，是一种白色或浅黄色有光泽的片状、柱状或针状结晶，有苦味。熔点为180℃～182℃，相对密度为1.405（20/4℃），溶于冷水、乙醇、微溶于乙醚，在水中的溶解性为137g/L（20℃），在空气中易潮解。在150℃时转变成硫氰酸铵。在真空下150-160℃时升华，180℃时分解。具有还原性，能使游离态碘还原成碘离子。遇明火、高热可燃，与氧化剂能发生强烈反应，受热分解，放出氮、硫的氧化物等毒性气体。硫脲分子结构式1.3检测方法综述文献调研表明目前国内未发现关于烟用添加剂中硫脲的检测标准，也未发现关于烟用添加剂中硫脲检测方法的相关研究。在所获得的文献报道中，硫脲检测方法表现为种类繁多、应用的样品环境千差万别。下面分三个部分介绍硫脲的检测方法发展趋势和代表性文献。1.3.1分光光度法硫脲用途的多样性，从而产生了样品种类的多样性，这一事实最终也导致了检测方法的多样性。在早期的相关研究中，硫脲主要以比色法定性检测为主。随着技术进步，采用分光光度计进行定量测定的检测方法也得到了不断发展。1977年，MandrouB.[1]等采用紫外分光光度法测定了柑桔皮中的硫脲，并且与AOAC的比色方法进行了比较，研究结果表明：AOAC的比色法较所建立的紫外分光光度法表现为：干扰物质多，检测结果偏高。1999年，AOAC公布了一系列关于硫脲的官方检测方法[2]，这些方法包括：AOAC948.18（橙汁中的硫脲定性测试程序）、AOAC948.19（橙汁中硫脲的迅速氧化方法）、AOAC948.20（冰冻桃子中硫脲的测定分光光度法）、AOAC961.10（桔子皮中硫脲的测定比色法）。2009年，AbbasiS.等[3]人采用动力学分光光度法建立了果汁中硫脲的检测方法。该方法的检测范围是0.01-12.00mg/L,检出限为0.008mg/L.该方法具有灵敏度高、选择性好等特点，能够应用于果汁和桔子皮中硫脲的检测。1.3.2色谱20世纪70年代开始，随着分析仪器的发展，针对食品类样品，涌现出大量的色谱检测方法。1979年，AkioHashimoto[4]采用盐析色谱和高效液相色谱（HPLC）共同结合的检测方法，分离和分析硫脲类似物（5种）和硫代乙酰胺组成的混合物，该方法被应用于土壤样品的检测，在160ng/ml的浓度水平条件下，回收率达99.3±2.66%。1979年，ToyodaM.等[5]建立了一种测定柑桔皮中硫脲的气液色谱(GLC)方法，在1ppm、10ppm和100ppm三个浓度水平情况下回收率为85.3、93.1、和97.6%，检测限低于0.08ppm。1981年，HKobayashi等[6]采用反相高效液相色谱和紫外检测器(RP-HPLC-UV)建立了生物材料中硫脲的检测方法，该方法采用甲醇和水作为流动相，检测波长设置为240nm,田鼠血浆样品经过乙醇提取、蒸发富集、硅胶纯化等步骤，最后采用反相液相色谱检测样品中的硫脲。1995年，BUA等[7]采用HPLC建立了测定水中硫脲的高效液相色谱方法，方法检出限为0.1μg/ml，方法回收率100-112%。1997年，AndreaRaffaelli[8]等采用大气压化学电离源选择反应监测模式建立了水中硫脲的液相色谱质谱（LC-MS）快速检测方法。2009年，黄晓兰等[9]建立了测定面条和米粉中硫脲的液相色谱-质谱/质谱（LC-MS/MS）检测方法，方法的检出限0.5μg/g，平均回收率83-90%。所报道的色谱方法主要是液相色谱法，涉及到的检测器有紫外检测器、质谱检测器等。1.3.3其他类型的检测方法由于样品的多用性，根据不同的样品需求，也有关于其他检测方法的报道。这些方法主要是针对工业生产产品质量控制需求和环保排放的相关要求,建立了大量的适用于不同样品类型的检测方法，具体检测方法包括：流动注射分析法[10]、原子吸收光谱法[11]、溶出伏安法[12]、化学发光法[13]等等。1.4小结从以上列举的方法可以看出，现有硫脲的分析检测方法主要是针对工业生产产品、环境样品和饮料等而建立的，其中AOAC方法针对固定对象采用比色法和分光光度法分别对橙汁、柑桔皮中的硫脲进行了定性和定量测定，这些方法对于烟草类添加剂中硫脲的测定具有借鉴意义。在梳理种类庞杂检测方法的基础上，项目组从本标准制订的适用范围（香精及料液）、普适性（烟草行业内仪器配置情况）出发，主要参考食品和果汁类样品的检测方法，选择了能够对复杂样品进行较好分离和分析的技术手段——高效液相色谱作为标准的框架，展开“烟用添加剂中硫脲的测定”的标准制订工作。项目组经过长期的研究和探索，采用高效液相色谱紫外检测器方法建立了烟用添加剂（香精和料液）中硫脲的检测方法标准。2标准适用范围本标准规定了烟用添加剂（香精和料液）中硫脲的测定方法——高效液相色谱法；本标准适用于烟用添加剂（香精和料液）中硫脲的测定。3原理烟用添加剂试样采用溶剂振荡萃取，用甲醇调节试样的溶剂环境后，经高效液相色谱仪分离，以紫外检测器测定，外标法定量。4实验方法4.1仪器常用实验仪器及下述各项。4.1.1高效液相色谱仪，配置柱温箱，具备梯度洗脱功能，紫外检测器4.1.2分析天平,感量0.1mg4.1.3振荡器，最大转速应大于1504.1.4离心机，最大转速应大于5000r/min。4.1.5有机滤膜，0.45µm4.2试剂和材料除特殊要求外，均使用分析纯试剂。4.2.1水，应符合GB/T6682中一级水的4.2.2甲醇，CH34.2.3乙腈，CH3CN，色谱纯4.2.4二氯甲烷，CH2Cl24.2.5硫脲，CH4N2S（CAS号：62-56-6），纯度≥994.2.6稀释溶剂，甲醇/水混合溶剂，体积比74.2.7标准溶液一级标准储备液:称取100mg（精确至0.1mg）硫脲(4.2.5)，用甲醇（4.2.2）溶解转移至100mL容量瓶中，用甲醇（4.2.2）定容至刻度。在2℃～8二级标准储备液:准确移取5.0mL一级储备液（）至100mL容量瓶中，用甲醇（4.2.2）稀释定容至刻度。在2℃～8标准工作溶液:分别准确移取100μL、500μL、1000μL、2000μL、4000μL、6000μL二级标准储备液（）至50mL容量瓶中，用稀释溶剂（4.2.6）定容至刻度，4.3试样前处理称取1g（精确至0.1mg）试样于50mL具塞的锥形瓶中，加入15mL水（4.2.1），在150r/min条件下振荡萃取10min，将振荡萃取液移入25mL具塞容量瓶中，用5mL水（4.2.1）清洗锥形瓶，将清洗溶液注入容量瓶中，并用水（4.2.1）定容至刻度，摇匀。移取10mL定容萃取液于10mL带塞的离心试管中，在5000r/min条件下离心10min，准确移取3mL上清液至10mL容量瓶中，用甲醇（4.2.2）定容，摇匀。取适量溶液过0.45μm滤膜（4.1.5），滤液用高效液相色谱仪分析，一个试样制备两个平行试样对于水不能分散的试样，按照以下方法处理。称取1g（精确至0.1mg）试样于50mL具塞的锥形瓶中，加入5mL二氯甲烷（4.2.4）将试样分散均匀，再准确加入25mL水（4.2.1），在150r/min条件下振荡萃取10min，静置分层，准确移取3mL上层水萃取溶液至10mL容量瓶中，用甲醇（4.2.2）定容，摇匀。取适量溶液过0.45μm滤膜（4.1.5），滤液用高效液相色谱仪分析，一个试样制备两个平行试样。若待测试样溶液的浓度超出标准工作曲线浓度范围，则对试样前处理适当调整后重新测定。4.4高效液相色谱条件以下分析条件可供参考，采用其它条件应验证其适用性。——色谱柱：XBridgeTMAmide，填料：硅胶键合乙酰氨基，规格：填料粒径3.5µm，250mm(长度)×4.6——流动相A：乙腈(4.2.3)；——流动相B：水（4.2.——柱温：35℃；——流速：0.7mL/min；——进样体积：10μL；——梯度洗脱程序见表1；——紫外检测器检测波长:λ=247nm。表1梯度洗脱程序时间min流动相A%流动相B%097312871313703023703024973349734.5标准曲线制作用高效液相色谱测定一系列硫脲标准工作溶液（），得到6个浓度水平的硫脲标准物质的液相色谱峰面积。用峰面积作为纵坐标，微克每毫升（μg/mL）计的硫脲标准物质浓度作为横坐标建立硫脲的表2标准工作溶液检测数据浓度μg/mL峰面积mAU*s0.10323.536960.309611.996880.516020.830841.032041.279162.064082.022744.1280165.24533图1标准工作曲线4.6试样测定结果烟用添加剂试样中硫脲含量按式（1）计算，X=……（1）式中X——试样中硫脲含量，单位为毫克每千克（mg/kg）；ci——标准工作曲线计算所得硫脲的浓度，单位为微克每毫升（µg/mL）；V——萃取体积，单位为毫升(mL)；ƒ——稀释系数（ƒ＝10/3）；m——试样质量，单位为克(g)。取两次平行测定结果的算术平均值作为试样测定结果，精确至0.01毫克每千克（mg/kg）。两次平行测定结果的相对平均偏差应不大于10％。5结果与讨论5.1色谱条件的选择5.1.1检测器及波长选择因为文献报道硫脲的高效液相色谱方法均选用紫外检测器，因此项目组对高效液相色谱紫外检测器法进行了考察。为了能够选择到最佳检测波长，项目组对硫脲标准物质的色谱峰进行了光谱扫描，色谱峰扫描紫外光谱图见图2。图2波长扫描图通过试样加标的方式，分别对文献报道的波长244nm、254nm和扫描图中的最大吸收波长247nm进行了比较。结果显示这三个波长的测定结果区别不大，但247nm的信号稍强，根据最大吸收波长原则，项目组最终选用247nm作为检测波长，建立烟用添加剂中硫脲的检测标准。5.1.2色谱柱的选择经过大量的摸索实验，项目组发现由于硫脲属于极性化合物，在液相反相色谱柱（填料：C18、C8）上很难保留，出峰时间小于3min（见图3、图4），出峰时间太早,对复杂样品而言很难做到准确检测。图3AgilentZorbaxExtend-C18（5.0μm,250×3.0mm）色谱图图4HPEclipseXDB-C8（5.0μm,150×4.6mm）色谱图为了使硫脲的色谱保留时间延长，达到与干扰物质完全分离的目的，项目组对3种亲水色谱柱进行考察，这三种色谱柱包括：①CarbohydrateCartridge（填料：硅胶键合氨基，规格：5.0µm,250×4.6mm）、②VenusilHILIC（填料：硅胶键合酰胺基，规格：5μm,250mm×4.6）、③WatersXBridgeTMAmide（填料：硅胶键合乙酰氨基，规格：3.5µm,250×4.6mm），根据这三种色谱柱的特性，选择最有利于延长保留时间的流动相和流速等色谱条件，考察了色谱柱对硫脲的保留效果，考察结果图5、图5CarbohydrateCartridge（5.0µm,250×4.6mm）色谱图图6VenusilHILIC（5μm,250mm×4.6）色谱图图7WatersXBridgeTMAmide（3.5µm,250×4.6mm）色谱图从以上3种不同的色谱柱来看，WatersXBridgeTMAmide的保留时间最长，效果最好，因此项目组采用WatersXBridgeTMAmide（3.5µm,250×4.6mm）作为本标准的色谱柱进行方法条件优化。所选择的色谱柱具有两个特点：①由于其键合官能团为乙酰氨基，因此该色谱柱实质上是一个正相柱，对极性物质有很好的保留；②该色谱柱可以采用一定比例的水作为流动相（一般正相色谱柱不能采用水作为流动相）。.3.1流动相组成在确定WatersXBridgeTMAmide（乙酰氨基）（3.5µm,250×4.6mm）作为分析柱的基础上，项目组根据该色谱柱适用的流动相条件（水相应低于50%），考察了不同流动相组合（甲醇-水、乙腈-水），考察实验结果见图8、图9。图8流动相为甲醇-水的标品色谱图图9流动相为乙腈-水的标品色谱图从图8和图9可以看出，选择这两种流动相都能得到较好的色谱峰。由于有机相比例越高，目标峰保留时间越长。在有机相起始比例为97%的条件下，采用甲醇-水流动相体系时，目标峰保留时间为5.156min,且3.5～5.0分钟之间有较多干扰峰，对于复杂的烟用添加剂试样而言，很容易出现目标峰与干扰峰重叠的情况。而采用乙腈-水作为流动相时，目标峰保留时间为：8.356min,且与干扰峰之间的距离足够远，所以项目组选用乙腈-水作为流动相。流动相pH值选择为了充分挖掘流动相在色谱分离上的效用，同时考虑检测过程中流动相pH值对硫脲稳定性的影响，项目组以乙腈-水作为流动相体系，采用添加助剂的方式，进一步考察了pH值对色谱分离的影响效果。所选择的样品是较为复杂的香料烟浸膏和橡苔浸膏，在完成样品加标后，分别用乙腈-水（pH=7.00）、乙腈（含0.02%乙酸）-水（含0.02%乙酸）（pH=4.08）、乙腈（含0.02%乙酸）-缓冲溶液（乙酸-乙酸铵,pH=5.06）、乙腈（含0.1%三乙胺）-水（含0.1%三乙胺）（pH=11.68）作为流动相，考察不同pH值的流动相对试样分离效果的影响。结果见图10、图11。图10在流动相不同pH值环境下的香料烟浸膏色谱图图11在流动相不同pH值环境下的橡苔浸膏色谱图从以上色谱图可以看出：流动相为纯的乙腈-水时，加标试样的色谱图峰形最好。乙腈和水在酸性环境下，干扰峰会增加，且部分样品目标峰峰形易变差。乙腈和水在碱性环境下，目标峰未检出。所以项目组选择乙腈-水作为本标准的流动相。.4.1梯度洗脱在确定色谱柱和流动相之后，项目组对液相色谱梯度和流速进行了优化，获得了标准中所列的推荐色谱梯度，具体梯度见表1，色谱流速见色谱条件（4.4）。色谱柱温度在液相色谱分析中，色谱柱应在稳定的温度下工作。项目组分别试验了温度为25℃、30℃、35℃、40℃，发现对试样测定结果影响不大。本标准色谱柱进样体积为了获得较好的保留，项目组在选择XBridgeTMAmide（乙酰氨基）梯度洗脱条件时，流动相A(乙腈)的初始比例为97%，该条件使硫脲能够较好的获得色谱柱的保留效果，使目标化合物和干扰物质能够做到很好的分离。但是这样的条件，也导致“色谱峰变形”的溶剂效应（试样溶剂条件在水绝对量过大的情况下，常规进样量10µL会出现溶剂效应（见图12））。当进样体积减小至1µL时，这种溶剂效应能得到有效的改善（见图13），但是如果进样体积过小，则会影响检测结果的稳定性。图12进样体积为10µL时标品色谱图（样品溶剂为水）图13进样体积为1µL时标品色谱图（样品溶剂为水）项目组在大量摸索实验的基础上，项目组发现采用甲醇调节样品溶剂环境，可以有效解决水作为样品环境时的色谱峰变形的问题，见图14。图14进样体积为10µL时标品色谱图（溶剂为V甲醇：V水=7:3体系）项目组经过样品溶剂环境调节后，通过比较，最终选择了10µL作为本标准的进样体积。5.2前处理步骤的选择及优化5.2.1空白试验不加样品，重复样品前处理步骤，进行高效液相色谱分析。检测结果未检出硫脲。因此在标准方法中，不需要进行空白试验以及不需要进行空白扣除。萃取步骤的优化萃取溶剂的选择影响香精及料液样品中硫脲提取的因素主要有两个——样品分散的均匀性和萃取溶剂的萃取效率。因此项目组在考虑烟用香精及料液样品在溶剂中的分散和硫脲从样品中萃取效率两个方面的因素后，参照已建立的“甜蜜素的测定”行业标准，将样品进行分类处理，分类类型包括：水能分散的试样和水不能分散的试样。对于水能分散的试样，选择了极性溶剂进行了萃取溶剂的考察。项目组考察了甲醇、乙醇、水等三种溶剂萃取料液试样和料液加标试样的情况，结果见图15、图16。图15料液试样色谱图图16料液加标试样色谱图从这两个图可以看出：用甲醇、乙醇、水萃取料液试样，均未检出目标峰，当萃取加标料液试样时，也都可以得到分离良好的色谱图，可是用甲醇和乙醇处理的料液加标试样色谱图明显比水处理的料液加标试样色谱图杂质峰多，考虑到烟用添加剂试样的复杂性，项目组决定采用水作为试样的萃取溶剂。另外，对于水不能分散的试样，项目组选用秘鲁浸膏（较为复杂的脂溶性样品），用三种不同的处理方法来萃取秘鲁浸膏试样和秘鲁浸膏加标试样，结果见图17，图18。这三种方法分别为：方法一：用乙醇直接萃取秘鲁浸膏；方法二：先用二氯甲烷萃取秘鲁浸膏后，再过SPE固相萃取柱（NH2柱）（活化后先用二氯甲烷清洗，再用甲醇洗脱）；方法三：先用二氯甲烷分散秘鲁浸膏，再用水反萃目标物质。图17秘鲁浸膏试样色谱图图18秘鲁浸膏加标试样色谱图从这两个图可以看出：用方法一处理秘鲁浸膏试样，有明显的干扰峰，用方法二和方法三处理秘鲁浸膏试样，没有检出目标峰，且无杂质干扰，而用方法一处理的秘鲁浸膏加标试样，干扰物质大拖尾，非常接近目标物质，用方法二处理的秘鲁浸膏加标试样,目标峰周围干扰最少。跟方法二相比，用方法三处理的秘鲁浸膏加标试样，目标峰周围的物质虽然比较多，但都与目标峰有一定的距离，分离效果也非常好，而且方法三的操作步骤比方法二的简单，所以项目组决定采用方法三，即先用二氯甲烷分散再用水萃取的方法萃取水不能分散的试样。萃取溶剂pH值选择在本文“流动相pH值选择”部分结果表明：流动相为酸、碱环境时，均会对硫脲的测定结果造成不利影响，而中性条件时测定结果较好，因此，选用萃取溶剂环境时，采用纯水作为方法的萃取溶剂。5.2.3由于进样时，试样中水的绝对比例过高会产生溶剂效应（描述见），经研究这一问题可以通过调节待测样溶剂环境来克服。项目组在进样量为10µL的条件下，考察了同一试样不同溶剂环境（V甲醇：V水=9:1、V甲醇：V水=8:2、V甲醇：V水=7:3、V甲醇：V水=6:4、V甲醇：V水=5:5、V甲醇：V水=4:6、V甲醇：V水=3:7、V甲醇：V水=2:8、V甲醇：V水=1:9）的色谱表现，结果见图19、图20。图19甲醇/水体积比为9:1/8:2/7:3的标品色谱图图20甲醇/水体积比为6:4/5:5/4:6/3:7的标品色谱图从上面的图可以看出：水的比例越小，峰形越好，峰宽越窄。当甲醇与水体积比为9:1、8:2和7:3时，色谱峰峰形较好，峰宽较窄。接下来，随着水的比例的增大峰形变宽，当甲醇与水体积比小于3：7之后，目标物质已经不具备完整峰形。考虑到甲醇与水体积比为9:1或8:2时，试样的稀释倍数太大，所以项目组决定采用甲醇与水体积比为7:3作为试样进样时的溶剂环境，即准确移取3mL水液至10mL容量瓶中，用甲醇定容。5.2.4其它前处理条件的选择水能分散的样品.1称样量经过试验考察试样前处理条件，结果表明：在25mL（水）萃取体积条件下,选取不同称样量——0.5g、1g、1.5g、2g、2.5g，的加标试样，实际检测结果表明，在0.5g.2萃取体积在1g称样量条件下，选取不同萃取溶剂体积——10mL、15mL、20mL、25mL、30mL的加标试样进行检测，实际检测结果表明，不同萃取体积对检测数据影响较小，项目组在考虑实际操作方便性和稀释倍数情况下选取：25mL作为萃取体积。.3萃取方式采用振荡萃取和超声萃取两种方式进行对比实验，结果表明振荡萃取和超声萃取均能获得满意结果，考虑到实验室的普适性和超声萃取附带的热效应问题，萃取方式选取振荡萃取方式。.4萃取时间在称样量、萃取方式、萃取体积确定的情况下，选取不同的萃取时间——5min、10min、15min、20min，检测发现对结果数据影响不大，考虑到萃取效率和稳定性问题，选取10min作为萃取时间。.5离心由于采用水作为萃取溶剂，部分试样中会发生乳化现象，为了获得稳定可靠的检测结果，在水溶性试样的前处理步骤中加入离心处理环节。在称样量、萃取体积、萃取方式、萃取时间确定的情况下，选取5000r/min条件下不同的离心时间——5min、10min、15min、20min进行考察，结果发现离心超过5min后，对检测结果影响不大，最终选取5000r/min条件下离心10min作为前处理步骤。水不能分散的样品.1称样量对于水不能分散的样品，经过试验考察前处理条件，结果表明：加入5mL二氯甲烷分散试样，再准确加入25mL水萃取的条件下,选取不同称样量——0.5g、1g、1.5g、2g.2萃取体积在1g称样量和加入5mL二氯甲烷分散试样的条件下，选取不同萃取溶剂体积——10mL、15mL、20mL、25mL、30mL进行加标试样检测，实际检测结果表明，不同萃取体积对检测数据影响较小，因此选取25mL作为萃取体积。.3萃取方式采用振荡萃取和超声萃取两种方式进行对比实验，结果表明振荡萃取和超声萃取均能获得满意结果，考虑到实验室的普适性和超声萃取附加的热效应问题以及两相萃取充分性问题，萃取方式选取：振荡萃取方式。.4萃取时间在称样量、萃取方式、萃取体积确定的情况下，选取不同的萃取时间——5min、10min、15min、20min，检测发现对结果数据影响不大，考虑到效率和稳定性问题，最终选取：10min作为萃取时间。5.3方法评价5.3.1检出限和定量限项目组用逐级稀释的方法找出仪器能检出的标准溶液的最低浓度。浓度值确定为0.0516µg/mL,项目组还考察了更低浓度0.0310µg/mL，结果见图21。图210.0310µg/mL的标品色谱图从图21可以看出：目标峰峰形已出现变形，所以项目组采用0.0516µg/mL作为最低浓度。最小浓度标准溶液10次进样,计算最低浓度检测结果的标准偏差（α），α=0.0017µg/mL，3α=0.0051µg/mL；代入公式（1）计算出，检出限：0.43mg/kg；（选取m=1.0000g，V=25mL）；定量限：1.425.3.2精密度分别对同一表香、料液和橡苔浸膏加标试样连续进样10次，计算其测定结果的相对标准偏差，结果见表3。表3精密度试验表香料液橡苔浸膏实测浓度mg/kg相对标准偏差%实测浓度mg/kg相对标准偏差%实测浓度mg/kg相对标准偏差%88.4669.9569.950.7482.470.2687.990.6087.4482.9288.2887.8870.6270.6270.6282.8788.2888.2782.6887.3487.4470.5470.5482.8988.0588.1882.9087.9787.0782.8487.5887.6869.2082.3387.7086.5082.5086.9386.8082.5586.81实验结果表明，表香、料液和橡苔浸膏加标试样的相对标准偏差分别为0.74%、0.26%和0.60%。说明本方法测定硫脲的精密度良好。5.3.3重复性为了考察整个方法的重复性，应用所建立的硫脲测定方法对试样进行日内和日间加标平行测定，日内表香、料液和橡苔浸膏试样各平行处理5份，日间各连续处理5天，结果见表4和表5。表4日内重复性试验试样加标浓度mg/kg实测浓度mg/kg实测浓度相对标准偏差%表香79.3074.290.6873.3173.2873.3072.97料液81.1972.931.1975.2074.0673.3674.34橡苔浸膏81.5276.140.4475.7176.2676.3975.65表5日间重复性试验试样检测天数天加标浓度mg/kg实测浓度mg/kg实测浓度相对标准偏差%表香179.3072.091.44274.20373.49473.60574.96料液181.1975.091.57274.43373.06475.69576.03橡苔浸膏181.5276.940.80275.48376.84476.90576.47同一试样同一天内平行处理5份和连续5天重复处理测定结果的相对标准偏差均在5％以内，说明本方法很稳定，重复性好。5.3.4储备液稳定性项目组将储备液分装后，在考察的时限点上，将储备液稀释-成同一浓度进行测定，结果见表6和图22。表6标准储备液在标准储存条件下的稳定性试验名称0天μg/mL7天μg/mL14天μg/mL21天μg/mL30天μg/mL40天μg/mLRSD%一级标准储备液1.021.021.011.001.010.991.16二级标准储备液1.021.021.011.010.990.952.68图22标准储备液稳定性趋势图从表6和图22可以看出，标准储备液在标准储备条件下30天内的稳定性较好，所以项目组采用标准储备液的储存条件为：在2℃～85.3.5试样把不同浓度的同一表香、料液橡苔浸膏加标试样常温下保存，在4℃条件下放置不同时间后进行测定，其结果见表7和表8、表9表7稳定性试验（表香加标试样）放置时间h水平1实测浓度mg/kg水平2实测浓度mg/kg水平3实测浓度mg/kg017.2888.32180.911217.4286.92177.302417.1186.04178.303617.4786.07178.054817.1585.31177.346017.0585.27176.727217.2484.83174.60相对标准偏差%0.901.381.07表8稳定性试验（料液加标试样）放置时间h水平1实测浓度mg/kg水平2实测浓度mg/kg水平3实测浓度mg/kg017.8387.96178.561217.7687.28176.802417.6184.13174.693617.6184.73174.184817.6285.56168.816017.2584.59170.707217.3283.20171.60相对标准偏差%1.222.011.99表9稳定性试验（橡苔浸膏加标试样）放置时间h水平1实测浓度mg/kg水平2实测浓度mg/kg水平3实测浓度mg/kg016.9088.00171.601216.8788.59172.952416.9288.01168.973617.0387.84168.764817.1287.38160.296017.1687.93159.087216.8386.21164.34相对标准偏差%0.750.863.26实验结果表明，在4℃条件下，试样溶液放置72小时过程中硫脲比较稳定，实测浓度的相对标准偏差都在5％以内，所以试样在3天内4℃5.3.6试样加标回收率对表香、料液和橡苔浸膏试样进行不同浓度水平的加标后，按照标准前处理步骤处理，计算其加标回收率，实验结果见表10。表10加标回收率试验试样名称加标浓度mg/kg实测浓度mg/kg回收率%表香——————19.0217.2890.8595.3688.0792.36190.98180.1794.34料液——————19.2317.6491.7395.6287.4891.49191.43177.4092.67橡苔浸膏——————18.6217.2692.7094.8288.2693.08185.56175.8894.785.3.7比对实验结果为了考察方法在不同实验室之间的再现性，取3个烟用添加剂样品（分别为表香、料液和橡苔浸膏），于2011年11月，分别在云南烟草科学研究院、红塔烟草（集团）有限责任公司、红云红河烟草（集团）有限责任公司、上海烟草集团有限责任公司、湖南中烟工业有限责任公司、云南省烟草质量监督检测站等6家实验室，采用本标准检测方法对选定样本进行了重复检测，验证结果表明：相同样品在不同实验室的测试结果具有良好的再现性。表11硫脲比对试验试样加标浓度mg/kg实测浓度mg/kg实测浓度RSD%实验室1实验室2实验室3实验室4实验室5实验室6表香————————————————42.0245.7644.2044.4944.146.8640.664.79151.32153.71156.55160.48154.36164.05147.063.64料液————————————————42.0444.6641.5044.138.1839.342.665.67151.19154.38151.40155.75142.48162.18145.774.28橡苔浸膏————————————————42.0239.5634.9139.1235.837.5540.46.59150.89142.18137.67144.6130.17144.68146.054.69表126家实验室仪器型号及仪器条件实验室仪器型号仪器条件实验室1Agilent1200采用本标准色谱条件实验室2Agilent1260实验室3Agilent主机1200，检测器1100。实验室4Waters2690实验室5Agilent1100实验室6DionexP680HPLC-RF20005.3.8试样测定为了证明所建立的分析方法的可靠性和普适性，项目组采用所建立本标准方法和HPLC-MS/MS方法（方法见附件二）同时测定了101个试样，在所有检测试样中两种方法检测均未发现硫脲。两种检测方法测定结果一致，这一事实说明本标准检测方法具有准确性和可靠性。在101个试样中，7个试样为固体、9个试样为膏状、85个试样为液体。不同的实测试样表明标准检测方法对不同性状试样测定具有普适性。

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附件一方法检出限和定量限检出限试验步骤：第一：用逐级稀释的方法找出仪器能检出的标准溶液的最低浓度。第二：配制包括该浓度水平的6个不同浓度水平的标准溶液，通过测定，以色谱峰高作为纵坐标，相应的体积浓度作为横坐标，制作标准曲线。试验结果和标准曲线见表1；第三：将最低浓度水平的标准溶液连续进样10次，试验结果见表2；第四：通过标准曲线计算出每个峰高对应的浓度值，计算浓度的标准偏差，用α表示。3α为检出限，单位为µg/mL；第五：将用µg/mL作为单位的检出限数值代入试样含量计算公式，最终计算出以mg/kg为单位的检出限。重复第四和第五个步骤，10α数值作为定量限计算基础，计算出定量限，单位为mg/kg。1最低浓度确定通过逐级稀释的方式寻找仪器能够检测的最低浓度，确定为0.0516µg/mL,项目组还考察了更低浓度0.0310µg/mL，结果见图1。图10.0310µg/mL的标品色谱图从图1可以看出：目标峰峰形不完整，所以项目组采用0.0516µg/mL作为标准曲线的最低点。2最低浓度检测数值的标准偏差项目组以最低浓度水平的标准溶液连续进样10次，采用峰高对浓度作图建立的标准曲线计算出每个峰高对应的浓度值，0.0516µg/mL标准溶液色谱图见图2。图20.0516µg/mL的标品色谱图从图2可以看出：以0.0516µg/mL作为标准曲线的最低点时，峰形不好，这种情况对峰高影响不大，但对峰面积影响较大，所以在对最低浓度检测结果进行计算时，采用峰高对浓度作图，建立峰高和浓度相对应的标准工作曲线。用目标峰高计算