《第3章 基因工程》知识总结

学而优·教有方PAGEPAGE12第三章基因工程第一节重组DNA技术的基本工具一、基因工程的概念1.基因工程的概念操作环境生物体外操作对象基因操作水平DNA分子水平操作原理基因重组操作结果按照人类的需要定向改造生物的遗传特性2．基因重组的类型（1）真核生物有性生殖过程中，减数分裂时发生的基因重组：①交换型；②自由组合型。（2）肺炎链球菌的转化实验中发生的基因重组。（3）基因工程中人工操作导致的基因重组。3．几乎所有生物的DNA分子都是由4种脱氧核苷酸形成的规则的双螺旋结构。4．所有生物都共用一套遗传密码。5．目的基因可在受体细胞内独立表达的原因是基因是控制生物性状的结构和功能单位，具有相对独立性。二、分子手术刀—限制性内切核酸酶1.全称和简称全称：_限制性内切核酸酶_简称：__限制酶_2.来源：主要是从_原核生物__中分离纯化出来的3.作用：①能够识别_双链_DNA分子的某种_特定核苷酸序列。②使_每一条_链中_特定部位_的_磷酸二酯键__断开。4.作用部位：_磷酸二酯键__5.识别序列：大多数限制酶的识别序列由_6_个核苷酸组成，也有少数限制酶的识别序列由_4_个、_8_个或__其他数量_的核苷酸组成。6.切割结果：DNA分子经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式__黏性末端_和__平末端__。（1）EcoRⅠ限制酶切割EcoRⅠ识别序列为GAATTCEcoRⅠ切割部位为GA之间的磷酸二酯键（2）SmaⅠ限制酶切割SmaⅠ识别序列为CCCGGGSmaⅠ切割部位为CG之间的磷酸二酯键二、分子缝合针—DNA连接酶1.功能：将__两个DNA片段连接起来_，恢复被限制酶切开的_磷酸二酯键__。2.分类和对比种类E·coliDNA连接酶T4DNA连接酶来源大肠杆菌T4噬菌体特点只缝合黏性末端缝合黏性末端平末端作用恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键3．比较与DNA有关的六种酶名称作用部位作用底物作用结果限制酶磷酸二酯键DNA将DNA切成两个片段DNA连接酶磷酸二酯键DNA片段将两个DNA片段连接为一个DNA分子DNA聚合酶或热稳定DNA聚合酶磷酸二酯键脱氧核苷酸将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端DNA(水解)酶磷酸二酯键DNA将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸解旋酶碱基对之间的氢键DNA将双链DNA分子局部解旋为单链，形成两条长链RNA聚合酶磷酸二酯键核糖核苷酸将单个核糖核苷酸依次连接到单链末端三、分子运输车——载体1．种类：质粒、噬菌体、动植物病毒等。2．常用载体——质粒（1）本质：质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。（2）质粒作为载体所具备的条件及原因条件原因稳定存在并能自我复制或整合到受体DNA上能使目的基因稳定存在且数量可扩增有一个至多个限制酶切割位点可携带多个或多种外源基因具有特殊的标记基因便于重组DNA分子的筛选无毒害作用对受体细胞无毒害作用，避免受体细胞受到损伤（3）作用①作为运输工具，将外源基因导入细胞。②质粒携带外源基因在细胞内大量复制。探究.实践：DNA的粗提取与鉴定1.提取思路：利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在的差异，选用适当的物理或化学方法对他们进行提取。2.提取原理：①DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精，利用这一原理，可以初步分离DNA与蛋白质；②DNA在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度不同，它能溶于2mol/L的NaCl溶液。3.鉴定原理：在一定温度下（沸水浴），DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色，因此二苯胺试剂可以作为鉴定DNA的试剂。4.比较DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同溶解规律2mol/LNaCl溶液0.14mol/LNaCl溶液DNA溶解析出5．DNA粗提取中的注意事项（1）本实验不能用哺乳动物成熟的红细胞作实验材料，原因是哺乳动物成熟的红细胞无细胞核(无DNA)。可选用鸡血细胞作材料。（2）加入洗涤剂后，动作要轻缓、柔和，否则容易产生大量的泡沫。加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。（3）二苯胺试剂要现配现用，否则会影响鉴定的效果。（4）提取植物细胞的DNA时，加入的洗涤剂能溶解细胞膜，有利于DNA的释放；加入食盐(主要成分是NaCl)的目的是溶解DNA。（5）在DNA进一步提纯时，选用冷却的95%的酒精的作用是溶解杂质和析出DNA。第二节基因工程的基本操作程序一、目的基因的筛选与获取（一）目的基因的筛选与获取1.目的基因概念在基因工程的设计和操作中，用于__改变受体细胞性状__或__获得预期表达产物_等的基因就是目的基因（根据不同的需要，目的基因是不同的，主要是指__编码蛋白质的基因___）。2.筛选目的基因的方法（1）从相关的__已知结构__和__功能清晰__的基因中进行筛选。（2）获取方法eq\b\lc\{\rc\(\a\vs4\al\co1(从基因文库中获取,利用PCR技术扩增,通过化学方法人工合成))3.利用PCR获取和扩增目的基因（1）PCR的概：PCR是__聚合酶链式反应__的缩写，是一项根据_DNA半保留复制_的原理，在_体外_提供参与DNA复制的__各种组分__与_反应条件_，对_目的基因的核苷酸序列_进行__大量复制__的技术。①全称：__聚合酶链式反应___②原理：___DNA半保留复制___③操作环境：__体外（PCR扩增仪/PCR仪）___④目的：__对目的基因的核苷酸序列进行大量复制___⑤优点：___可以在短时间内大量扩增目的基因___（2）DNA体内复制的条件参与的组分在DNA复制中的作用DNA母链提供DNA复制的模板4种脱氧核苷酸合成DNA子链的原料解旋酶打开DNA双链DNA聚合酶催化合成DNA子链引物使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸注：引物是一小段能与_DNA母链__的一段碱基序列__互补配对_的_短单链核酸__。（3）DNA体外复制（PCR）的条件参与的组分在DNA复制中的作用DNA母链提供DNA复制的模板4种脱氧核苷酸合成DNA子链的原料引物使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸90℃以上高温打开DNA双链（变性温度）耐高温的DNA聚合酶催化合成DNA子链缓冲液（含Mg2+)激活真核细胞和细菌的DNA聚合酶其他不同的温度变性、复性和延伸需要不同温度注：复制的原料实为dNTP（dATP、dTTP、dCTP、dGTP），同时水解产生能量为合成DNA子链提供能量，因此体系中不需要添加ATP。（4）过程目的基因DNA__受热变性__后_解为单链_，_引物与单链相应_互补序列_结合；然后以__单链DNA__为模板在_DNA聚合酶_作用下进行_延伸__，即将4种_脱氧核苷酸__加到__引物的3’__，如此__重复循环多次__，每次循环一般可以分为_变性、复性和延伸_三步。注：变性温度上升到90℃左右，双链DNA解聚为单链复性温度下降到55℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合延伸温度上升到72℃左右，Taq酶从引物起始合成互补链，可使新链由5′端向3′端延伸拓展：DNA复制的相关计算1.子代DNA分子总数：_2n_个；2.第n代产生的DNA数：_2n-1_个；3.子代DNA脱氧核苷酸链总数=_2n+1_条4.第n代产生的DNA链数：_2n_条①n代后，DNA分子有_2n_个②n代后，DNA链有_2n+1_条③第____代出现完整的目的基因④n代后，含引物的DNA分子有_2n__个⑤n代后，共消耗_2n+1-2_个引物⑥第n代复制，消耗了_2n_个引物⑦n代后，完整的目的基因有_2n-2n_个4.获取目的基因的其他方法（1）构建基因文库来获取目的基因：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。①基因组文库：包含一种生物所有的基因。②部分基因文库：只包含一种生物一部分基因，如cDNA文库。（2）利用化学方法人工合成：用DNA合成仪，要获取的基因比较小，核苷酸序列又已知，不需要模板。（二）基因表达载体的构建（核心）1.基因表达载体的组成基因表达载体必须包括_目的基因_、__标记基因_、_启动子_、_终止子_等（若需要能完成自主复制，还应有_复制原点_）。（1）启动子①本质：一段有特殊序列结构的_DNA_片段。②位置：位于基因的_上游_，紧挨__转录的起始位点__。③功能：RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA___。④特殊类型：_诱导型启动子___。⑤诱导型启动子的特点：当诱导物存在时，可以激活或抑制目的基因的表达__。（2）终止子①本质：一段有特殊序列结构的_DNA__片段。②位置：位于基因的_下游_。③功能：使转录在所需要的地方停下来__。注：启动子、终止子、起始密码子、终止密码子对比比较项目启动子终止子起始密码子终止密码子本质DNA片段DNA片段mRNA上三个相邻的碱基mRNA上三个相邻的碱基位置目的基因上游目的基因下游mRNA首端mRNA尾端功能RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA使转录在所需要的地方停下来翻译的起始信号（编码氨基酸）翻译的结束信号（不编码氨基酸）（3）标记基因①作用：_便于重组DNA分子的筛选_②常见类型：抗生素抗性基因、荧光蛋白基因等（4）基因表达载体的构建过程一般用同种或能产生相同末端的限制酶分别切割载体和含有目的基因的DNA片段，再利用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体的切口处(如图所示)。（三）将目的基因导入受体细胞1.将目的基因导入植物细胞—花粉管通道法（1）操作方式①用__微量注射器_将__含目的基因的DNA溶液_直接注入_子房_中。②在_植物受粉后_的一定时间内，_剪去柱头_，将__DNA溶液___滴加在_花粉管通道__上，使目的基因借助_花柱切面__进入_胚囊_。（2）受体细胞：_受精卵__。2.将目的基因导入植物细胞—农杆菌转化法（1）转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程__。注：此处“转化”与肺炎链球菌转化实验中的“转化”含义相同，实质都是基因重组。（2）农杆菌特点：①能在自然条件下侵染__双子叶植物_和_裸子植物__，而对大多数__单子叶植物_没有侵染能力。②农杆菌细胞内含有__Ti质粒_，当它侵染植物细胞后，能将_Ti质粒_上的_T-DNA_（可转移的DNA）转移_到被侵染的细胞，并且将其__整合到该细胞的染色体DNA上__。（3）农杆菌转化法的过程：将目的基因插入_Ti质粒的T-DNA__中，通过农杆菌的_转化_作用，就可以使目的基因_进入植物细胞_，并___整合到受体细胞的染色体DNA上__，使目的基因能够_维持稳定和表达__。3.将目的基因导入动物细胞—显微注射法1.受体细胞：_受精卵_注：受精卵容易表现出全能性。构建基因表达载体并提纯2.构建基因表达载体并提纯4.将目的基因导入微生物细胞—Ca2+处理法（1）受体细胞：常用__原核生物__作为受体细胞，其中以__大肠杆菌_最广泛（2）原核生物的优点：_繁殖快、单细胞、遗传物质相对较少、易于培养__（3）Ca2+处理法（感受态细胞法）的一般过程：（四）目的基因的检测与鉴定检测目的检测方法判断标准目的基因是否插入转基因生物的DNADNA分子杂交技术是否出现杂交带目的基因是否转录出了mRNA分子杂交技术是否出现杂交带目的基因是否翻译出蛋白质抗原—抗体杂交技术是否出现杂交带个体水平的检测如抗虫、抗病的接种实验是否表现出相应的特性1.DNA片段的电泳鉴定（1）实验原理：DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。带电粒子在电场作用下，向与其携带电荷相反的电极移动。（2）影响DNA分子的迁移率的因素：DNA的分子大小，DNA分子的构象，凝胶的浓度。（3）电泳出现位置不等的几条条带，说明存在长短不一的DNA片段，鉴定的PCR产物不纯净。第三节基因工程的应用一、基因工程在农牧业方面的应用分类实例处理或作用转基因抗虫植物转基因抗虫棉、玉米、大豆、水稻和马铃薯从某些生物中分离出抗虫基因导入作物，使之具有抗虫性状。可减少因化学农药的使用而造成的环境污染和对人类健康的损害，降低生产成本、提高产量

。转基因抗病植物抗病毒转基因甜椒、番木瓜和烟草等将源于某些病毒、真菌等的抗病基因导入作物,培育出抗病作物。抗病毒的目的基因病毒外壳蛋白基因抗真菌的目的基因几丁质酶基因转基因抗逆植物抗除草剂玉米、转鱼抗寒基因番茄等抗逆性基因：调节细胞渗透压的基因(提高作物抗盐碱、抗干旱)；抗除草剂基因；鱼的抗冻蛋白基因。改良植物的品质高赖氨酸玉米、含大量纤维素的转基因玉米、转基因矮牵牛改善植物的营养成分含量（如氨基酸、蛋白质）或提升观赏价值等。提高动物的生长速率转生长激素基因的鲤鱼由于外源生长激素基因的表达可以使转基因动物生长更快，可将这类基因导入动物体内，以提高动物的生长速率。改善畜产品的品质转肠乳糖酶基因牛将肠乳糖酶基因导入奶牛基因组，使获得的转基因牛分泌的乳汁中，乳糖的含量大大降低。二、基因工程在医药卫生领域的应用分类实例处理或作用转基因动物生产药物乳腺生物反应器（乳房生物反应器）将药用蛋白基因与乳腺中特异表达的基因的启动子等调控元件重组在一起。转基因动物作器官移植的供体克隆猪器官抑制或除去抗原决定基因，结合克隆技术培育出没有免疫排斥反应的转基因克隆猪器官。

基因治疗镰状细胞贫血的治疗方案基因治疗的策略主要有基因置换、基因修复、基因增补、基因失活等。三、基因工程在食品工业方面的应用淀粉酶、凝乳酶、天冬氨酸和苯丙氨酸等的生产利用基因工程菌生产食品工业用酶、氨基酸和维生素等。如将编码牛凝乳酶的基因导入大肠杆菌、黑曲霉或酵母菌的基因组中，再通过工业发酵生产凝乳酶。四、乳腺生物反应器与基因工程菌生产药物比较比较项目乳腺生物反应器工程菌基因表达合成的药物蛋白与天然蛋白质相同细菌细胞内没有内质网、高尔基体等细胞器，产生的药物蛋白可能没有活性。受体细胞动物的受精卵微生物细胞导入目的基因的方式显微注射技术感受态细胞法药物提取从动物乳汁中提取从微生物细胞中提取第四节基因工程的延伸——蛋白质工程一、蛋白质工程：是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。1.概念理解（1）基础：蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系。（2）操作：基因修饰或基因合成。

（3）结果：改造了现有蛋白质或制造出新的蛋白质。

（4）目的：根据人们对蛋白质功能的特定需求，对蛋白质结构进行分子设计。

2.操作过程从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列（基因）或合成新的基因→获得所需要的蛋白质。二、蛋白质工程崛起的缘由1.基因工程的实质：将一种生物的_基因转移到另一种生物体内，后者可以产生它本不能产生的蛋白质，进而表现出新的性状。2.基因工程的局限性：__只能生产自然界中已存在的蛋白质____3.蛋白质工程崛起的缘由：（1）基因工程原则上只能生产自然界中已存在的蛋白质。（2）天然蛋白质是生物长期进化过程中形成的，它们的结构和功能符合特定物种生存的需要，却不一定完全符合人类生产和生活的需要。二、蛋白质工程的基本原理1.蛋白质工程的目标：根据人们对蛋白质__功能__的特定需求，因此要对蛋白质的__结构_进行设计改造。2.蛋白质工程的实质：__改造或合成基因（定向改造现有蛋白质或制造新的蛋白质）。3.天然蛋白质合成过程：天然蛋白质合成的过程是按照__中心法则__进行的。基因→表达→形成具有特定氨基酸序列的多肽链→形成具有高级结构的蛋白质→形式生物功能4.蛋白质工程思路蛋白质工程与天然蛋白质合成的过程_相反_，而从__预期的蛋白质功能_出发→设计_预期的蛋白质结_→推测__应有的氨基酸序列_→找到并改变_相对应的脱氧核苷酸序列_或__合成新基因_→获得所需要的蛋白质。三、蛋白质工程和基因工程的比较比较项目蛋白质工程基因工程操作对象基因基因操作起点预期蛋白质功能目的基因操作水平DNA分子水平DNA分子水平操作流程预期蛋白质功能→设计蛋白质结构→推测氨基酸序列→找到并改变对应的脱氧核苷酸序列（基因）或合成新基因→获得所需要的蛋白质目的基因的筛选与获取→构建基因表达载体→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定结果可生产自然界没有的蛋白质可生产自然界已有的蛋白质实质通过改造或合成基因来定向改造现有蛋白质或制造新的蛋白质将一种生物的基因转移到另一种生物体内，后者可以产生它本不能产生的蛋白质，进而表现出新的性状联系①蛋白质工程是在基因工程基础上延伸出来的第二代基因工程；②蛋白质工程离不开基因工程，其包含基因工程基本操作。四、蛋白质工程的应用1.医药工业方面（1）科学家通过对胰岛素基因的改造，研发出速效胰岛素类似物产品。（2）eq\x(干扰素半胱氨酸)eq\o(→,\s\up7(改造))eq\x(干扰素丝氨酸)体外很难保存，但在体外－70℃下可以保存半年（3）人－鼠嵌合抗体：降低免疫反应强度。2.其他工业方面利用蛋白质工程获得枯草杆菌蛋白酶的突变体，筛选出符合工业化生产需求的突变体，提高该酶的使用价值。农业方面①科学家尝试改造某些参与调控光合作用的酶，以提高植物光合作用的效率，增加粮食的产量。②科学家利用蛋白质工程的思路设计优良微生物农药，通过改造微生物蛋白质的结构，增强微生物防治病虫害的效果。4.其他（1）改进酶的性能或开发新的工业用酶。（2）改造某些参与调控光合作用的酶，以提高植物光合作用的速率，增加粮食的产量。（3）改造微生物蛋白质的结构，使它防治病虫害的效果增强。5.蛋白质工程现状蛋白质工程是一项难度很大的工程；主要原因是蛋白质发挥功能必须依赖于正确的高级结构，而这种高级结构往往十分复杂。学而优·教有方PAGEPAGE23第三章基因工程第一节重组DNA技术的基本工具一、基因工程的概念1.基因工程的概念操作环境生物体外操作对象基因操作水平DNA分子水平操作原理基因重组操作结果按照人类的需要定向改造生物的遗传特性2．基因重组的类型（1）真核生物有性生殖过程中，减数分裂时发生的基因重组：①交换型；②自由组合型。（2）肺炎链球菌的转化实验中发生的基因重组。（3）基因工程中人工操作导致的基因重组。3．几乎所有生物的DNA分子都是由4种脱氧核苷酸形成的规则的双螺旋结构。4．所有生物都共用一套遗传密码。5．目的基因可在受体细胞内独立表达的原因是基因是控制生物性状的结构和功能单位，具有相对独立性。二、分子手术刀—限制性内切核酸酶1.全称和简称全称：_限制性内切核酸酶_简称：__限制酶_2.来源：主要是从_原核生物__中分离纯化出来的3.作用：①能够识别_双链_DNA分子的某种_特定核苷酸序列。②使_每一条_链中_特定部位_的_磷酸二酯键__断开。4.作用部位：_磷酸二酯键__5.识别序列：大多数限制酶的识别序列由_6_个核苷酸组成，也有少数限制酶的识别序列由_4_个、_8_个或__其他数量_的核苷酸组成。6.切割结果：DNA分子经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式__黏性末端_和__平末端__。（1）EcoRⅠ限制酶切割EcoRⅠ识别序列为GAATTCEcoRⅠ切割部位为GA之间的磷酸二酯键（2）SmaⅠ限制酶切割SmaⅠ识别序列为CCCGGGSmaⅠ切割部位为CG之间的磷酸二酯键二、分子缝合针—DNA连接酶1.功能：将__两个DNA片段连接起来_，恢复被限制酶切开的_磷酸二酯键__。2.分类和对比种类E·coliDNA连接酶T4DNA连接酶来源大肠杆菌T4噬菌体特点只缝合黏性末端缝合黏性末端平末端作用恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键3．比较与DNA有关的六种酶名称作用部位作用底物作用结果限制酶磷酸二酯键DNA将DNA切成两个片段DNA连接酶磷酸二酯键DNA片段将两个DNA片段连接为一个DNA分子DNA聚合酶或热稳定DNA聚合酶磷酸二酯键脱氧核苷酸将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端DNA(水解)酶磷酸二酯键DNA将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸解旋酶碱基对之间的氢键DNA将双链DNA分子局部解旋为单链，形成两条长链RNA聚合酶磷酸二酯键核糖核苷酸将单个核糖核苷酸依次连接到单链末端三、分子运输车——载体1．种类：质粒、噬菌体、动植物病毒等。2．常用载体——质粒（1）本质：质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。（2）质粒作为载体所具备的条件及原因条件原因稳定存在并能自我复制或整合到受体DNA上能使目的基因稳定存在且数量可扩增有一个至多个限制酶切割位点可携带多个或多种外源基因具有特殊的标记基因便于重组DNA分子的筛选无毒害作用对受体细胞无毒害作用，避免受体细胞受到损伤（3）作用①作为运输工具，将外源基因导入细胞。②质粒携带外源基因在细胞内大量复制。探究.实践：DNA的粗提取与鉴定1.提取思路：利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在的差异，选用适当的物理或化学方法对他们进行提取。2.提取原理：①DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精，利用这一原理，可以初步分离DNA与蛋白质；②DNA在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度不同，它能溶于2mol/L的NaCl溶液。3.鉴定原理：在一定温度下（沸水浴），DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色，因此二苯胺试剂可以作为鉴定DNA的试剂。4.比较DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同溶解规律2mol/LNaCl溶液0.14mol/LNaCl溶液DNA溶解析出5．DNA粗提取中的注意事项（1）本实验不能用哺乳动物成熟的红细胞作实验材料，原因是哺乳动物成熟的红细胞无细胞核(无DNA)。可选用鸡血细胞作材料。（2）加入洗涤剂后，动作要轻缓、柔和，否则容易产生大量的泡沫。加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。（3）二苯胺试剂要现配现用，否则会影响鉴定的效果。（4）提取植物细胞的DNA时，加入的洗涤剂能溶解细胞膜，有利于DNA的释放；加入食盐(主要成分是NaCl)的目的是溶解DNA。（5）在DNA进一步提纯时，选用冷却的95%的酒精的作用是溶解杂质和析出DNA。第二节基因工程的基本操作程序一、目的基因的筛选与获取（一）目的基因的筛选与获取1.目的基因概念在基因工程的设计和操作中，用于__改变受体细胞性状__或__获得预期表达产物_等的基因就是目的基因（根据不同的需要，目的基因是不同的，主要是指__编码蛋白质的基因___）。2.筛选目的基因的方法（1）从相关的__已知结构__和__功能清晰__的基因中进行筛选。（2）获取方法eq\b\lc\{\rc\(\a\vs4\al\co1(从基因文库中获取,利用PCR技术扩增,通过化学方法人工合成))3.利用PCR获取和扩增目的基因（1）PCR的概：PCR是__聚合酶链式反应__的缩写，是一项根据_DNA半保留复制_的原理，在_体外_提供参与DNA复制的__各种组分__与_反应条件_，对_目的基因的核苷酸序列_进行__大量复制__的技术。①全称：__聚合酶链式反应___②原理：___DNA半保留复制___③操作环境：__体外（PCR扩增仪/PCR仪）___④目的：__对目的基因的核苷酸序列进行大量复制___⑤优点：___可以在短时间内大量扩增目的基因___（2）DNA体内复制的条件参与的组分在DNA复制中的作用DNA母链提供DNA复制的模板4种脱氧核苷酸合成DNA子链的原料解旋酶打开DNA双链DNA聚合酶催化合成DNA子链引物使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸注：引物是一小段能与_DNA母链__的一段碱基序列__互补配对_的_短单链核酸__。（3）DNA体外复制（PCR）的条件参与的组分在DNA复制中的作用DNA母链提供DNA复制的模板4种脱氧核苷酸合成DNA子链的原料引物使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸90℃以上高温打开DNA双链（变性温度）耐高温的DNA聚合酶催化合成DNA子链缓冲液（含Mg2+)激活真核细胞和细菌的DNA聚合酶其他不同的温度变性、复性和延伸需要不同温度注：复制的原料实为dNTP（dATP、dTTP、dCTP、dGTP），同时水解产生能量为合成DNA子链提供能量，因此体系中不需要添加ATP。（4）过程目的基因DNA__受热变性__后_解为单链_，_引物与单链相应_互补序列_结合；然后以__单链DNA__为模板在_DNA聚合酶_作用下进行_延伸__，即将4种_脱氧核苷酸__加到__引物的3’__，如此__重复循环多次__，每次循环一般可以分为_变性、复性和延伸_三步。注：变性温度上升到90℃左右，双链DNA解聚为单链复性温度下降到55℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合延伸温度上升到72℃左右，Taq酶从引物起始合成互补链，可使新链由5′端向3′端延伸拓展：DNA复制的相关计算1.子代DNA分子总数：_2n_个；2.第n代产生的DNA数：_2n-1_个；3.子代DNA脱氧核苷酸链总数=_2n+1_条4.第n代产生的DNA链数：_2n_条①n代后，DNA分子有_2n_个②n代后，DNA链有_2n+1_条③第____代出现完整的目的基因④n代后，含引物的DNA分子有_2n__个⑤n代后，共消耗_2n+1-2_个引物⑥第n代复制，消耗了_2n_个引物⑦n代后，完整的目的基因有_2n-2n_个4.获取目的基因的其他方法（1）构建基因文库来获取目的基因：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。①基因组文库：包含一种生物所有的基因。②部分基因文库：只包含一种生物一部分基因，如cDNA文库。（2）利用化学方法人工合成：用DNA合成仪，要获取的基因比较小，核苷酸序列又已知，不需要模板。（二）基因表达载体的构建（核心）1.基因表达载体的组成基因表达载体必须包括_目的基因_、__标记基因_、_启动子_、_终止子_等（若需要能完成自主复制，还应有_复制原点_）。（1）启动子①本质：一段有特殊序列结构的_DNA_片段。②位置：位于基因的_上游_，紧挨__转录的起始位点__。③功能：RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA___。④特殊类型：_诱导型启动子___。⑤诱导型启动子的特点：当诱导物存在时，可以激活或抑制目的基因的表达__。（2）终止子①本质：一段有特殊序列结构的_DNA__片段。②位置：位于基因的_下游_。③功能：使转录在所需要的地方停下来__。注：启动子、终止子、起始密码子、终止密码子对比比较项目启动子终止子起始密码子终止密码子本质DNA片段DNA片段mRNA上三个相邻的碱基mRNA上三个相邻的碱基位置目的基因上游目的基因下游mRNA首端mRNA尾端功能RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA使转录在所需要的地方停下来翻译的起始信号（编码氨基酸）翻译的结束信号（不编码氨基酸）（3）标记基因①作用：_便于重组DNA分子的筛选_②常见类型：抗生素抗性基因、荧光蛋白基因等（4）基因表达载体的构建过程一般用同种或能产生相同末端的限制酶分别切割载体和含有目的基因的DNA片段，再利用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体的切口处(如图所示)。（三）将目的基因导入受体细胞1.将目的基因导入植物细胞—花粉管通道法（1）操作方式①用__微量注射器_将__含目的基因的DNA溶液_直接注入_子房_中。②在_植物受粉后_的一定时间内，_剪去柱头_，将__DNA溶液___滴加在_花粉管通道__上，使目的基因借助_花柱切面__进入_胚囊_。（2）受体细胞：_受精卵__。2.将目的基因导入植物细胞—农杆菌转化法（1）转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程__。注：此处“转化”与肺炎链球菌转化实验中的“转化”含义相同，实质都是基因重组。（2）农杆菌特点：①能在自然条件下侵染__双子叶植物_和_裸子植物__，而对大多数__单子叶植物_没有侵染能力。②农杆菌细胞内含有__Ti质粒_，当它侵染植物细胞后，能将_Ti质粒_上的_T-DNA_（可转移的DNA）转移_到被侵染的细胞，并且将其__整合到该细胞的染色体DNA上__。（3）农杆菌转化法的过程：将目的基因插入_Ti质粒的T-DNA__中，通过农杆菌的_转化_作用，就可以使目的基因_进入植物细胞_，并___整合到受体细胞的染色体DNA上__，使目的基因能够_维持稳定和表达__。3.将目的基因导入动物细胞—显微注射法1.受体细胞：_受精卵_注：受精卵容易表现出全能性。构建基因表达载体并提纯2.构建基因表达载体并提纯4.将目的基因导入微生物细胞—Ca2+处理法（1）受体细胞：常用__原核生物__作为受体细胞，其中以__大肠杆菌_最广泛（2）原核生物的优点：_繁殖快、单细胞、遗传物质相对较少、易于培养__（3）Ca2+处理法（感受态细胞法）的一般过程：（四）目的基因的检测与鉴定检测目的检测方法判断标准目的基因是否插入转基因生物的DNADNA分子杂交技术是否出现杂交带目的基因是否转录出了mRNA分子杂交技术是否出现杂交带目的基因是否翻译出蛋白质抗原—抗体杂交技术是否出现杂交带个体水平的检测如抗虫、抗病的接种实验是否表现出相应的特性1.DNA片段的电泳鉴定（1）实验原理：DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。带电粒子在电场作用下，向与其携带电荷相反的电极移动。（2）影响DNA分子的迁移率的因素：DNA的分子大小，DNA分子的构象，凝胶的浓度。（3）电泳出现位置不等的几条条带，说明存在长短不一的DNA片段，鉴定的PCR产物不纯净。第三节基因工程的应用一、基因工程在农牧业方面的应用分类实例处理或作用转基因抗虫植物转基因抗虫棉、玉米、大豆、水稻和马铃薯从某些生物中分离出抗虫基因导入作物，使之具有抗虫性状。可减少因化学农药的使用而造成的环境污染和对人类健康的损害，降低生产成本、提高产量

。转基因抗病植物抗病毒转基因甜椒、番木瓜和烟草等将源于某些病毒、真菌等的抗病基因导入作物,培育出抗病作物。抗病毒的目的基因病毒外壳蛋白基因抗真菌的目的基因几丁质酶基因转基因抗逆植物抗除草剂玉米、转鱼抗寒基因番茄等抗逆性基因：调节细胞渗透压的基因(提高作物抗盐碱、抗干旱)；抗除草剂基因；鱼的抗冻蛋白基因。改良植物的品质高赖氨酸玉米、含大量纤维素的转基因玉米、转基因矮牵牛改善植物的营养成分含量（如氨基酸、蛋白质）或提升观赏价值等。提高动物的生长速率转生长激素基因的鲤鱼由于外源生长激素基因的表达可以使转基因动物生长更快，可将这类基因导入动物体内，以提高动物的生长速率。改善畜产品的品质转肠乳糖酶基因牛将肠乳糖酶基因导入奶牛基因组，使获得的转基因牛分泌的乳汁中，乳糖的含量大大降低。二、基因工程在医药卫生领域的应用分类实例处理或作用转基因动物生产药物乳腺生物反应器（乳房生物反应器）将药用蛋白基因与乳腺中特异表达的基因的启动子等调控元件重组在一起。转基因动物作器官移植的供体克隆猪器官抑制或除去抗原决定基因，结合克隆技术培育出没有免疫排斥反应的转基因克隆猪器官。

基因治疗镰状细胞贫血的治疗方案基因治疗的策略主要有基因置换、基因修复、基因增补、基因失活等。三、基因工程在食品工业方面的应用淀粉酶、凝乳酶、天冬氨酸和苯丙氨酸等的生产利用基因工程菌生产食品工业用酶、氨基酸和维生素等。如将编码牛凝乳酶的基因导入大肠杆菌、黑曲霉或酵母菌的基因组中，再通过工业发酵生产凝乳酶。四、乳腺生物反应器与基因工程菌生产药物比较比较项目乳腺生物反应器工程菌基因表达合成的药物蛋白与天然蛋白质相同细菌细胞内没有内质网、高尔基体等细胞器，产生的药物蛋白可能没有活性。受体细胞动物的受精卵微生物细胞导入目的基因的方式显微注射技术感受态细胞法药物提取从动物乳汁中提取从微生物细胞中提取第四节基因工程的延伸——蛋白质工程一、蛋白质工程：是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过改造或合成基因，来改造现有蛋白质，或