《复方木鸡颗粒治疗肝硬化的药效实证探究》6000字（论文）

PAGE22-PAGE21-复方木鸡颗粒治疗肝硬化的药效实证研究目录TOC\o"1-2"\h\u1746复方木鸡颗粒治疗肝硬化的药效实证研究 -1-23521摘要 -1-7283英文缩略词表 -2-15725前言 -2-3230材料与方法 -3-148801实验材料 -3-30761.1仪器 -3-174181.2药材 -3-71921.3主要试剂 -3-143381.4主要试剂的配制 -4-191251.5细胞株 -4-100402实验方法 -4-153702.1复方木鸡颗粒各组分的制备 -4-15242.2HSC-T6细胞培养 -5-145362.3细胞分组及给药 -5-126732.4不同组分的均匀设计 -7-2794实验结果 -9-36821探讨试验设计方法 -10-14222均匀设计引入配方比研究 -10-18753结论 -11-14514参考文献 -11-摘要目的：复方木鸡颗粒具有预防及治疗的“双保险”功能，又被誉为“满药第一方”，源于满族医药验方“木鸡汤”，由木鸡、核桃楸皮、山豆根及菟丝子4味药组成。当前对于复方木鸡颗粒治疗肝病的配伍规律研究甚少，因此本课题采用现代药理学相关方法进行复方木鸡颗粒治疗肝硬化药效组分配伍规律研究，并预测治疗肝硬化最佳配伍组合及剂量。材料与方法：复方木鸡颗粒各组成药材进行提取及纯化，得到六组不同组分；体外培养大鼠肝星状细胞HSC-T6细胞并给药，采用CellcountingKIT-8(CCK-8)试剂盒检测细胞的增值活性，以抑制率为指标，筛选药效组分；同时采用均匀设计法，将核桃楸皮黄酮、山豆根生物碱、菟丝子黄酮以及山豆根多糖四个组分作为考察因素，每个因素各设12个水平，以抑制率为指标，通过SPSS采用逐步回归法拟合方程，预测最佳组合及剂量。结果：采用CellcountingKIT-8(CCK-8)试剂盒检测细胞的增值活性，对比不同组分抑制率，筛选出4个组分，采用均匀设计法，将核桃楸皮黄酮、山豆根生物碱、菟丝子黄酮以及山豆根多糖四个组分作为考察因素，调整剂量，使最终给药浓度为2mg/mL，以抑制率为指标，采用逐步回归法拟合方程Y=45.1268＋1.4643X3＋0.8625X4。预测最佳组合为核桃楸皮黄酮（X3）为5.55mg，山豆根生物碱（X4）为8.12mg，预测相应抑制率为58.44%结论：针对复方木鸡颗粒治疗肝硬化临床应用，确定复方最佳组合及剂量，为后续复方木鸡颗粒的相关研究奠定实验基础。关键词：复方木鸡颗粒；组分配伍；均匀设计；肝硬化英文缩略词表英文缩写英文全称中文全称DMEMDulbecco'sModifiedEagleMedium细胞培养基DMSODimethylsulfoxide二甲基亚砜FBSFetalBovineSerum胎牛血清HSC-T6Hepaticstellatecell肝星状细胞PBSPhosphateBufferedSaline磷酸盐缓冲液前言复方木鸡颗粒原方出自满族医药经典验方木鸡汤，其具有双保险功能[1]。文献调研发现，临床上复方木鸡颗粒治疗肝病方面应用广泛，不仅能治疗肝炎、肝纤维化和肝硬化，同时可防治肝癌且能治疗神经母细胞瘤。药理研究方面发现，复方木鸡颗粒具有抗菌抗癌、降低血清谷丙转氨酶和诱导肝癌细胞凋亡等药理作用。从中医配伍规律研究方面发现，复方中木鸡作为君药具有直接消除活性氧或自由基的作用[2]。核桃楸皮和山豆根作为臣药，菟丝子作为佐使药[3]，其配伍具有"扶正而不留邪，祛邪而不伤正"综合性调理作用[4]。中药复方组成复杂，因此需要注重复方质量控制使达到临床疗效。中药复方具有规律性和整体性，只测定药物指标或毒性成分来作为检测标准具有一定不合理性，只看单一成分存在不科学性，应整体探究组方配伍规律，调查药效成分、组方配伍规律。目前，对于复方木鸡颗粒治疗肝硬化配伍规律研究较少。本文旨在采用现代药理学相关方法进行复方木鸡颗粒治疗肝硬化药效组分配伍规律研究，并预测最佳配伍组合及剂量。材料与方法1实验材料仪器HD2-BCN-1360B型生物洁净工作台（哈尔滨东联电子技术开发有限公司）；SUNRISE型酶标仪（瑞士TECAN公司）；USAUTOFLOW型CO2培养箱（德国NUAIRE公司）；AE31型倒置相差显微镜（Motic公司）1.2药材核桃楸皮、菟丝子、山豆根、云芝药材由丹东药业提供，经辽宁中医药大学许亮教授鉴定为胡桃科植物核桃楸JuglansmandshuricaMaxim.的干燥树皮[5]、菟丝子亚科植物菟丝子CuscutachinensisLam.的干燥成熟种子[6]、豆科植物越南槐SophoratonkinensisGagnep.的干燥根和根茎[7]、多孔菌科真菌彩绒革盖菌Coriolusversicolor(L.exFr.)Quel的干燥子实体[8]，使用药材破碎机进行粉碎，过1号筛。其余过四号筛。1.3主要试剂胎牛血清北京全式金生物技术有限公司DMEM高糖培养基美国GIBCO公司二甲基亚砜Sigma公司胰蛋白酶美国GIBCO公司细胞增殖及毒性检测试剂盒（CCK-8）大连美仑生物技术有限公司娃哈哈纯净水杭州娃哈哈集团有限公司青、链霉素混合溶液美国Hyclone公司碳酸氢钠，氯化钠，氯化钾，磷酸氢二钾，磷酸二氢钠均为分析级别，购于西陇化工股份有限公司。不同直径大小的0.22μm滤膜购于美国Millipore公司；细胞培养瓶、孔板购于美国Corning公司。1.4主要试剂的配制DMEM（Dulbecco'sModifiedEagleMedium）完全培养液的配制：将FBS（FetalBovineSerum）置于56℃水浴环境加热灭活30min，自然恢复至室温，过0.22μm滤器并分装至经高温高压灭菌处理过的容器中，之后使用移液枪按照10%（v:v）的比例精确吸取转移到盛装有DMEM的容器内；按照1%（v:v）的比例精确吸取青链霉素混合溶液，转移到盛装上述混有FBS的DMEM的容器内，混匀，即得。细胞冻存液的配制：取经过灭活、过滤处理的FBS，与DMSO（Dimethylsulfoxide）按照9:1（v:v）的比例混匀，即得。PBS（PhosphateBufferedSaline）的配制按照本实验室细胞培养SOP进行。1.5细胞株小鼠肝星状细胞HSC-T6（Hepaticstellatecell）（赛百慷（上海）生物技术股份有限公司）。2实验方法2.1复方木鸡颗粒各组分的制备2.1.1核桃楸皮黄酮称取适量预粉碎的核桃楸皮药材粉末，以15倍生药量的60%乙醇加热回流两次，每次1h，合并二次滤液，水浴加热浓缩至0.1g/mL生药浓度，以同体积的AB-8湿树脂进行纯化，2倍柱体积三级水除杂后12倍柱体积60%乙醇洗脱，洗脱液重复上述纯化方法进行二次纯化，二次洗脱液水浴加热浓缩至近干，减压干燥，即得[9]。2.1.2菟丝子黄酮称取适量预粉碎的菟丝子药材粉末，以15倍生药量的95%乙醇加热回流3次，每次1.5h，合并三次滤液，水浴加热浓缩至0.1g/mL生药浓度，用HCl和NaOH将浓缩液pH调至5，以1.1倍体积的HPD-400湿树脂进行纯化，2倍柱体积三级水除杂后4倍柱体积60%乙醇洗脱，洗脱液水浴加热浓缩至近干，减压干燥，即得[10]。2.1.3山豆根生物碱称取适量预粉碎的山豆根药材粉末，以10倍生药量65%乙醇加热回流2次，每次2h，合并二次滤液，水浴加热浓缩至0.8g/mL生药浓度，用HCl和NaOH将浓缩液pH调至5，以0.8倍体积的HPD-300湿树脂进行纯化，2倍柱体积三级水洗除杂后8倍柱体积65%乙醇进行洗脱，二次洗脱液水浴加热浓缩至近干，减压干燥，即得[11]。2.1.4菟丝子粗多糖称取适量预粉碎的菟丝子药材粉末，以20倍生药量的三级水加热回流2次，每次1h，合并二次滤液，水浴加热浓缩至0.5g/mL生药浓度，加入过量80%乙醇混匀，静置醇沉24h，滤过后水溶除杂，加热稍浓缩后涂于高温清洁灭菌处理过的搪瓷托盘内壁，置入真空干燥装置内常温干燥。2.1.5山豆根粗多糖称取适量预粉碎的山豆根药材粉末，以10倍量三级水加热回流3次，每次1h，合并三次滤液，水浴加热浓缩至1.0g/mL生药浓度，加入过量75%乙醇混匀，静置醇沉12h，同“2.1.4”中方法进行除杂和干燥[12]。2.1.6云芝粗多糖称取适量预粉碎的云芝药材粉末，以30倍量三级水加热回流3次，每次2h，合并三次滤液，水浴加热浓缩至1.0g/mL生药浓度，加入过量70%乙醇混匀，静置醇沉24h，同“2.1.4”中方法进行除杂和干燥。2.2HSC-T6细胞培养从-80℃冰箱中取出细胞冻存管，迅速置37℃水浴中，不断振摇，待冻存管内液体完全溶解，1300r·min-1离心5min，用酒精棉球擦拭消毒外壁，移入超净台，弃上清，加入培养液，吹打成细胞悬液，接种于培养瓶内，并置CO2培养箱（37℃，5%CO2）中培养，次日或隔日换液；细胞为贴壁生长细胞，隔日换液，细胞长至90%以上进行传代培养，严格按照无菌操作。2.3细胞分组及给药将HSC-T6细胞接种于含体积分数为10%胎牛血清的DMEM高糖培养基中，置37℃、5%CO2饱和湿度的条件下常规培养。2天换液，依据细胞生长密度进行传代一次，取对数生长期、生长状态良好的细胞1瓶，经PBS清洗两次，用0.25%胰蛋白酶消化，待细胞变小变圆用含10%胎牛血清的DMEM培养液冲洗吹打细胞，制成单细胞悬液。细胞计数板上计数，合理稀释细胞悬液密度，并接种于96孔培养板，每孔100µL（除空白调零孔外，接种密度约为每孔8000左右细胞），继续培养至细胞贴壁完全。设调零组：只加培养液。空白对照组：只加HSC-T6细胞。弃去每孔原培养液，每孔给药150µL，空白对照孔、调零孔补加150µL含10%太牛血清的DMEM培养基，每组分别设5个复孔。继续培养箱培养24h后，吸弃药液，加入10%CCK-8溶液，避光培养2.5h后，计算各组分给药后，细胞的增殖活性。各组分药效结果见表1-1~1-4所示。表1-1核桃楸皮黄酮对HSC-T6细胞抑制作用的考察编号给药浓度（mg/mL）平均OD值（±s）抑制率（%）100.91±0.03-20.30.74±0.28*40.4430.60.58±0.12*63.9240.90.45±0.04*65.74注：与空白对照组比较，*P＜0.05表1-2菟丝子黄酮对HSC-T6细胞抑制作用的考察编号给药浓度（mg/mL）平均OD值（±s）抑制率（%）101.91±0.03-21.50.84±0.02*13.3632.00.68±0.01*44.7242.50.45±0.24*50.40注：与空白对照组比较，*P＜0.05表1-3山豆根生物碱对HSC-T6细胞抑制作用的考察编号给药浓度（mg/mL）平均OD值（±s）抑制率（%）100.91±0.03-21.50.74±0.02*4.83320.58±0.02*17.9142.50.45±0.04*60.67注：与空白对照组比较，*P＜0.05表1-4菟丝子多糖、山豆根多糖、云芝多糖对HSC-T6细胞抑制作用的考察编号给药浓度（mg/mL）平均OD值（±s）抑制率（%）101.86±0.03-菟丝子多糖1.20.84±0.02*20.362.40.78±0.02*26.723.60.75±0.04*28.65山豆根多糖1.22.43.60.82±0.02*12.360.58±0.24*44.720.55±0.04*58.33云芝多糖1.22.43.61.65±0.048.361.61±0.048.721.64±0.048.40注：与空白对照组比较，*P＜0.05楸皮黄酮、山豆根生物碱、菟丝子黄酮、山豆根多糖作用于HSC-T6细胞，均有抑制作用，且在一定范围内呈剂量依赖性。以上四种组分，楸皮黄酮的抑制作用最强，山豆根生物碱次之，菟丝子黄酮第三，山豆根多糖最弱。2.4不同组分的均匀设计将核桃楸皮黄酮、山豆根生物碱、菟丝子黄酮以及山豆根多糖四个组分作为考察因素，每个因素各设12个水平；按照均匀设计表U12*(1210)及其使用表，依据各组分别确定的楸皮黄酮、山豆根生物碱、菟丝子黄酮以及山豆根多糖确定的对HSC-T6细胞的剂量范围，进行试验设计，共得到12种配伍组合，均匀设计给药表见2-3，并进行剂量调整最终给药浓度为2mg/mL。表2-110因素12水平表12345678910112345689101222468101235711336912251114104481237116101955102712416118661251141092877718293411568831161912725995110627312410107411182129311119753110862121211109875431表2-2U12*(1210)使用表S列号D2150.116331690.1838416790.223351348100.227261267890.26707126789100.2768表2-3给药表水平山豆根生物碱mg菟丝子黄酮mg楸皮黄酮mg山豆根多糖mg15.2650.5500.0004.280212.0282.0420.4650.00034.3402.6900.8245.32048.0285.0860.1601.34053.4683.1401.6506.36067.6954.6841.5521.38073.1760.0002.21410.40088.8400.1422.8652.42091.0651.8502.4256.440106.0203.4563.6483.460110.0003.7283.2687.480126.0865.8205.8864.500实验结果本实验选用U12*(1210)均匀设计表，涉及10因素，12水平，将核桃楸皮黄酮、山豆根生物碱、菟丝子黄酮以及山豆根多糖四个组分作为考察因素。细胞培养及给药方式同2.3项下。分别观察12个配伍组对HSC-T6细胞的抑制作用。计算细胞的增殖活性。各配伍组的作用效果见表2-4。表2-4四种组分不同配伍组对HSC-T6细胞的作用（±s，n=5）组别抑制率（%）组别抑制率（%）150.00±14.43750.56±10.39242.55±13.08854.32±13.36355.84±15.34944.72±12.49456.52±12.101045.99±10.44556.17±12.641140.16±12.24664.32±16.341234.33±10.69以抑制率为指标，采用逐步回归法拟合方程，得到抑制率（Y）与四种组分，即山豆根多糖（X1）、菟丝子黄酮（X2）、核桃楸皮黄酮（X3）、山豆根生物碱（X4）的关系如下表2-5。表2-5数学模型变量偏相关系数标准差标准偏相关系数TP常数项55.7958.5421-3.240.0103楸皮黄酮1.46430.02740.97005.680.0004山豆根生物碱0.86250.03410.28233.220.0643拟合F=16.80，P=0.0005，X1、X2被剔除，进入模型的是X3、X4，R²=0.6640，即上述三个组分因素解释了抑制率为66.4%。多重线性回归方程可表达为：Y=45.1268＋1.4643X3＋0.8625X4。预测最佳组合为X3=5.55mg，X4=8.12mg，预测相应抑制率为58.44%。讨论1探讨试验设计方法基线等比设计，一般是针对药对的药效研究，适用面窄。筛选试验设计，是多因素两水平的线性模型，具有快捷高效的特点，但不考虑交互作用，适用于药味间无明显作用的研究或筛选主要药味[13，14，15，16]。星点设计，具有经济、一定预测性的特点，适用于因素连续可控、药效明确的研究[17]。中心组合设计，具有精准度高特点，但需多次重复试验，适用于精准优化的研究[18]。均匀设计，是多因素多水平的线性模型，试验次数少且覆盖面全，药味剂量多时、优化配伍剂量比时可用此方法考察，但结果精准度差[19]。正交设计，在组方优化中应用最为广泛，其特点是整齐可比，具有简便快速的优点，但因素多时，试验次数繁多，试验范围狭窄，适用于筛选主要药味[20]。2均匀设计引入配方比研究数学系统建模可能是对中药成分及中药复杂药理作用进行强有力的数学分析的重要途径[21]。本实验研究采用均匀设计法，探讨复方木鸡颗粒治疗肝硬化的最佳组方配伍规律。均匀设计法是基于正交设计法“正交分散”理论上建立的试验设计方法，该方法能够降低试验次数、增多试验因素和水平数，提高了试验效率，等同试验次数下就可获得全面有效数据结果[22]。结论1复方木鸡颗粒各组药材进行提取及纯化，得到6组不同组分，体外培养大鼠肝星状细胞HSC-T6细胞并给药，采用CellcountingKIT-8(CCK-8)试剂盒检测细胞的增值活性，以抑制率为指标，筛选出4个药效组分：核桃楸皮黄酮、山豆根生物碱、菟丝子黄酮以及山豆根多糖。2复方木鸡颗粒治疗肝硬化疗效显著，本次实验对其药效组分进行配伍设计，研究其配伍规律，确定复方木鸡颗粒组分治疗肝硬化的最佳组合，并构建了拟合方程，得到了其发挥药效的组合剂量并预测了相应抑制率，采用逐步回归法拟合方程为Y=45.1268＋1.4643X3＋0.8625X4。预测最佳组合为核桃楸皮黄酮（X3）为5.55mg，山豆根生物碱（X4）为8.12mg，预测相应抑制率为58.44%。本次研究也为后续复方木鸡颗粒不同配伍组指纹图谱的构建及谱效关系研究奠定实验基础。参考文献[1]费菲,詹洪春.向民族医药新梦想进发——中国“满药之都”呼之欲出——2014第三届满族医药国际论坛现场报道[J].中国医药科学,2014,4(18):1-6.[2]ChangYJ,ZhangM,JiangYF,etal.PreclinicalandclinicalstudiesofCoriolusversicolorpolysaccharopeptideasanimmunotherapeuticinChina[J].DiscovMed,2017,23(127):207-219.[3]金黎明,胡文忠,侯梦阳.满药复方木鸡颗粒防治肝病的研究进展[J].广州中医药大学学报,2017,34(2):292-296.[4]宋玉荣,姜春霞.满药复方木鸡颗粒研究新进展[J].中国医药报,2013,10(1):4-5.[5]吴静娟.核桃楸皮等有效成分的药理与临床应用[J].中成药,2004,26(3):230-232.[6]郭澄,王雅君,张剑萍.菟丝子的化学成分和药理活性研究[J].时珍国医国药,2005,16(10):1035-1036.[7]崔健,耿惠.山豆根在复方中化学成分变化的研究[J].中草药,2001,32(7):613-614.[8]张松.云芝子实体多糖和菌丝体多糖的分离纯化研究[D].北京中医药大学,2009.9郑莹，王帅，孟宪生,等.基于量效融合评价的正交优选核桃楸皮抗肝SMMC-7721肿瘤黄酮类成分的提取工艺[J].中药材，2013，36(10)：1686-1689.10LombardiD,DittrichPS.Advancesinmicrofluidicsfordrugdiscovery[J].ExpertOpiniononDrugDisco,2010,5(11):1081-1094.11杨帆.山豆根生物碱成分的提取分离及抗氧化、抗肿瘤活性研究[D].长春师范学院,2012.12尹龙萍,邓毅,贾伟,等.山豆根粗多糖最优化提取工艺研究[J].中药材,2007(3):351-353.[13]PLACKETTRL,BURMANJP.Thedesignofoptimummultifactorialexperiments[J].Biometrika,1946,33(4):303-325.[14]

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