《烟草及烟草制品 植物甾醇的测定 液相色谱-串联质谱法》技术报告

《烟草及烟草制品中植物甾醇的测定高效液相色谱－串联质谱法》技术报告1前言植物甾醇是植物性甾体化合物，它不仅是植物细胞的重要组成成分，也是一种重要的植物活性成分，其基本结构为环戊氢化菲体系[1]。目前烟草中已报道植物甾醇主要有胆甾醇、菜油甾醇、豆甾醇和-谷甾醇，霉变烟叶中还可能含有麦角甾醇[2,3]。除游离态甾醇外，甾醇类化合物还以结合态存在，结合态包括与脂肪酸结合成酯、与糖类的羟基形成糖苷键的配糖类物质，以及酰基配糖类化合物[4,5]。有研究对152个随机选择的烟草样品中植物甾醇的含量进行测定，发现其含量范围在0.1–0.3％之间[6]。烟草中植物甾醇主要存在于细胞膜中，不但能促进烟草生长，而且对烟草的安全、品质都有较大的影响。有研究表明烟草中的甾醇是卷烟烟气致癌物多环芳烃的主要前体物，卷烟烟气中61％的苯并[a]芘是由它裂解产生的[7-10]。不同于食品和其它植物中的甾醇，在卷烟抽吸时约有20％～25％的烟草植物甾醇完整的转移到主流和侧流烟气中，甾醇中的羟基，高温热解时会与其母体的四轮环戊烯[]菲环结构形成稠环芳烃化合物[11,12]。Stedman[13]的研究表明豆甾醇在750℃下热解生成苯并[]芘；Badger等[14,15]的研究表明，在豆甾醇的裂解过程中，发生了甾醇骨架的一系列单分子反应后形成了菲、蒽等多环芳烃。由于烟草中植物甾醇是卷烟烟气中苯并[]芘生成的前体化合物[7]，对烟草及其制品中的植物甾醇进行准确定量分析，全面了解烟草中甾醇的存在形态、含量和分布情况，获得其对卷烟烟气中苯并[]芘释放量的影响，对促进卷烟的减害降焦研究具有重要的参考价值。目前我国还没有烟草及其制品中植物甾醇含量测定的标准方法，而卷烟降焦减害研究工作的深入对烟草中植物甾醇的准确测定提出了需求，迫切需要准确测定烟草及其制品中植物甾醇的标准方法。国内外对植物甾醇的分析方法进行了广泛研究。由于甾醇一般存在于复杂的食品或植物的脂类中，要准确测定植物甾醇的含量，需经过萃取分离，纯化富集、定量检测等分析步骤[16,17]。其中，植物组织或含油的种子中分离植物甾醇一般采用溶剂萃取、柱层析、固相萃取、超临界萃取或超临界流体分馏后，对纯化物进行定量分析。植物甾醇定量方面，目前主要采用反相(正相)高效液相色谱柱色谱、薄层色谱、毛细管电色谱、气相色谱。检测器多使用氢离子火焰检测器、紫外检测器、蒸发光散射检测器、红外检测器和质谱检测器。随着色谱技术的发展，复杂基质中植物甾醇的分析方法有了非常大的发展[18]。烟草及其制品中植物甾醇的测定方法的文献报道主要有：Jiu等[19]研究了GC/MS/MS定量测定游离植物甾醇的方法，烟草甾醇被提取后就可直接进样分析。许燕娟等[20]采取三氯甲烷萃取烟草中的甾醇类物质，取上层清液过滤后直接进样，氢火焰离子化检测器测定了烟草中四种主要的甾醇，前处理方法十分简单。黄龙等[21]建立了一种采用二氯甲烷提取、微孔滤膜过滤、气相色谱/质谱/选择离子监测(GC/MS/SIM)定量测定烟草中游离植物甾醇的方法，该法适合批量烟叶样品中甾醇的定量分析。张骏松[22]等研究了以丙酮为提取剂、三甲基氯硅烷和六甲基二硅胺烷作衍生化剂，毛细管气相色谱法测定烟草中的甾醇,取得满意结果。刘少民等[16]采用浓盐酸水解、KOH乙醇溶液皂化、正己烷萃取、双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)衍生化和气相色谱法测定了不同种类、不同品种、不同产地、不同部位烟叶样品中游离态和结合态的甾醇。上述方法均采用气相色谱分析，前处理方法主要有两种，提取液直接进样和衍生化。由于甾醇类物质沸点很高，如果不经衍生化，样品容易在色谱升温过程中分解，故提取液直接进样重现性差。国家标准“GB25223-2010-T动植物油脂甾醇组成和甾醇总量的测定”采用的是衍生化气相色谱法，但衍生化样品前处理操作非常麻烦。液相色谱法也是植物甾醇测定的常用方法。由于甾醇紫外吸收很弱，紫外检测器检测时需衍生化；用蒸发光散射检测器可直接检测甾醇，但选择性差，对于基体复杂的样品无法实现分离[18]。由于烟草属于基体复杂的样品，所以这些方法难以在烟草甾醇测定中得到实际应用。液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)不仅检测灵敏度高，还可通过两级选择离子获得很高的选择性，是非挥发性成分定量、定性测定的有效手段，该技术也广泛用于植物甾醇分析[18,23,24]。采用LC-MS/MS法可不经过衍生化直接测定烟草及其制品中的游离甾醇。与衍生化气相色谱法相比，样品前处理大大简化。由于液相色谱串联质谱联用仪在烟草烟草行业已逐步普及，具备了方法推广应用的条件，而且液相色谱串联质谱测定甾醇方法操作相对简单，在其它样品甾醇测定中得到广泛应用、方法成熟、测定结果可靠。在综合考虑各种文献报道方法和其它国家、行业标准方法的基础上，项目将建立用高效液相色谱-串联四级杆质谱测定烟草及其制品中游离甾醇(胆甾醇、豆甾醇、-谷甾醇、麦角甾醇和胡萝卜甙)的方法，并在大量实验的基础上建立相关的烟草行业标准。图1植物甾醇的化学结构式(1)6-酮胆甾烷醇(2)胡萝卜甙(3)麦角甾醇(4)胆甾醇(5)豆甾醇(6)β－谷甾醇2实验部分2.1仪器与试剂API4000QTRAP质谱仪（美国应用生物系统公司）；WatersAcquity超高效液相色谱仪（美国Waters公司）；Milli-Q50超纯水仪（美国Millipore公司）；；BT224S电子天平（感量0.1mg，德国Sartorius公司）。除特别要求外，均应使用色谱纯试剂，水应符合GB/T6682中一级水的规定。试剂标准品包括：麦角甾醇（ergosterol），纯度≥99%；胆甾醇（cholesterol），纯度≥95%，豆甾醇（stigmasterol），纯度≥95%；β－谷甾醇（β-sitosterol），纯度≥98%；谷甾醇-3-O-葡萄糖苷/胡萝卜甙（beta-Sitosterol-3-O-glucoside），纯度≥92.9%；6-酮胆甾烷醇（6-Ketocholestanol），纯度≥98%，均购自加拿大Chromadex

公司。2.2标准溶液的配制2.2.1植物甾醇标准溶液标准储备液分别称取5mg（精确至0.1mg）胡萝卜甙、麦角甾醇、胆甾醇、和β－谷甾醇、豆甾醇至10mL容量瓶中，用少量二氯甲烷溶解，再用甲醇稀释并定容至刻度，配制成浓度均为0.5mg/mL的标准储备液。该标准储备液在2～8℃下保存可储存3个月。一级混合标准储备液分别准确移取麦角甾醇、胡萝卜甙、胆甾醇、豆甾醇和β－谷甾醇的标准储备液0.5、1.0、1.0、1.0、1.0mL至25mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度。配制成麦角甾醇、胡萝卜甙、胆甾醇、豆甾醇和β－谷甾醇浓度分别为10、20、20、20、20g/mL的一级混合标准溶液。该溶液置于2～8℃下保存，有效期为3个月。2.2.2内标溶液内标储备液称取5.0mg的6-酮胆甾烷醇至10mL容量瓶中，用少量二氯甲烷溶解，甲醇定容至刻度。在2～8℃下保存，有效期3个月。一级内标溶液移取1mL内标储备液至25mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成浓度为20.0μg/mL的一级内标溶液。该溶液于2～8℃条件下保存，有效期为3个月。标准工作溶液分别移取0.1、0.2、0.5、1.0、5.0和10.0mL植物甾醇一级混合标准储备溶液置于6个的25mL容量瓶中，再分别准确加入0.2mL一级内标溶液。用萃取溶液定容至刻度，配制成6级标准工作溶液。内标浓度为160ng/mL。若样品浓度超出标准工作溶液浓度范围，可适当扩展工作溶液覆盖范围。萃取溶液移取8mL一级内标溶液置于1000mL的容量瓶中，用甲醇定容至刻度。配制成含内标160ng/mL的甲醇萃取溶液。2.3样品分析2.3.1样品的制备根据行业标准“YC/T31-1996烟草及烟草制品试样的制备和水分测定烘箱法”的方法制备试样。2.3.2样品前处理称取0.2g（精确至0.1mg）试样于100mL具塞锥形瓶中，准确加入40.0mL萃取溶液，振荡萃取2.0h后，静置5min。取1mL萃取液过0.22μm滤膜，移至色谱分析瓶后立即进样分析。2.4参考的液相色谱、质谱条件和目标分析物保留时间依据高效液相色谱-质谱联用仪的仪器性能，优化色谱、质谱参数，实现分离与鉴定的最佳结合。以下参数作为相同型号仪器分析参考，采用不同仪器分离鉴定前应进行条件优化，以提高方法的精密度和灵敏性。2.4.1超高效液相色谱条件——色谱柱：C18柱（1.7μm，2.1×100mm）或等效柱；本项目研究使用WatersAcquityUPLCBEHC181.7μm，2.1×100mm分析柱；——流速：0.4mL/min；——柱温：40℃；——进样量：5μL；——流动相A：甲醇，流动相B：去离子水；——梯度洗脱条件如表1所示。表1超高效液相色谱梯度洗脱条件时间min流动相A%流动相B%095.05.06.0100.007.5100.008.095.05.012.095.05.02.4.2普通高效液相色谱条件——色谱柱：C18柱（5.0μm，3.9×150mm）或等效柱；本项目研究使用WatersXTerraRPC185μm，3.9×150mm分析柱；——流速：0.4mL/min；——柱温：40℃；——进样量：5μL；——流动相A：甲醇，流动相B：去离子水；——梯度洗脱条件如表2所示。表2普通型高效液相色谱梯度洗脱条件时间min流动相A%流动相B%098.02.010.0100.0011.098.02.015.098.02.02.4.3质谱参考条件——离子源：大气压化学电离源（APCI）；——扫描方式：正离子扫描；——检测方式：多反应监测（MRM）；——电喷雾电压：5500V；——离子源温度：650℃；——辅助气Gas1压力：60psi；——辅助气Gas2压力：70psi；——各分析物的质谱检测参数见表4。表3质谱检测参数表分析物定量离子对m/zDPVCEVCXPV定性离子对m/zDPVCEVCXPV麦角甾醇379.5/69.328394.0379.5/159.2283915.0胆甾醇369.3/147.237339.0369.3/161.337329.0豆甾醇395.5/83.141364.0395.5/147.3383715.0β－谷甾醇397.5/161.324299.0397.5/147.224299.0胡萝卜甙397.5/147.224299.0397.5/161.324299.06-酮胆甾烷醇403.4.4/385.3441610403.4/367.4502010.0注：DP，CE，CXP分别为去簇电压、碰撞能量和碰撞池电压2.5烟草及烟草制品中游离甾醇的定性和定量测定将标准工作溶液依次分析进样，得到每个目标化合物与内标的峰面积之比及浓度比，根据峰面积之比和浓度之比绘制标准工作曲线，相关系数大于等于0.99。定性分析：每种被测组分选择1个母离子，2个或2个以上子离子，在相同实验条件下，样品中待测物质的相对保留时间与标准工作溶液中对应的保留时间偏差在±2.5%之内。将样品谱图中各组分特征离子的相对丰度与浓度相近的标准工作溶液中对应的特征离子的相对丰度进行比较，当相对丰度＞50%时，允许偏差±20%；当相对丰度在20~50%时，允许偏差±25%；当相对丰度在10~20%时，允许偏差±30%；当相对丰度＜10%时，允许偏差±50%。定量分析：烟草及烟草制品中五种游离甾醇的含量由式（1）计算得出：……（1）式中：X——样品中游离甾醇的含量，单位为微克每克（μg/g）；C——从标准工作曲线上得到游离甾醇浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；v——样品萃取液定容体积，单位为毫升(mL)；m—试样质量，单位为克(g)；取两次平行测定结果的算术平均值作为测定结果，精确至0.01μg/g。两次平行测定结果之间的相对偏差应不大于10.0％。3结果与讨论3.1内标的选择液质联用定性分析多采用内标法。选择同系物作为内标物，由于它们的化学性质基本相同，可以最大限度地减少因为样品损失造成的分析误差，提高结果的准确性。选择同系物内标法定量，查阅大量文献，发现6-酮胆甾烷醇不仅在结构上与待测物有类似的在保留时间和定量方面都具有较强的优势，且不是烟草及烟草制品的固有成分。故确定6-酮胆甾烷醇作为内标物质来进行定量。3.2不同萃取方式的选择选取具有代表性的样品分别进行振荡2h和回流萃取30min。如表6所示。实验结果表明，振荡的萃取2h的效率与回流萃取30min效率相当，考虑到回流萃取操作繁琐、且不能批量处理样品，故选择振荡萃取作为样品的萃取方式。图2不同萃取方式的萃取效率（μg/g）3.3萃取溶剂的选择为考察不同溶剂对游离甾醇的萃取情况，选取了甲醇、正己烷、环己烷、乙酸乙酯、二氯甲烷对样品进行振荡萃取，并在相同条件下进行分析。结果表明，甲醇萃取体系得到的色谱图峰型分离较好。故采用甲醇作为萃取溶液。图3不同萃取体系的比较3.4称样量稳定性和萃取溶剂体积选择分别取同一个样品0.2、0.3、0.4、0.5g，分别加入20、30、40和50mL甲醇萃取溶液进行交叉实验，从图4现无论从甾醇含量还是稳定性来说，每次实验的样品量控制在0.2g，都能达到良好的稳定性，随着样品量的增加无论萃取效率和稳定性均没有明显差异或改善，其变异系数都在12%以下。考虑到称样量少于0.2g，不能反映整体，多于0.2g会对离子源造成一定的污染，故本实验选取0.2g称样量。图4不同称样量下的变异系数从图5中可以看出，固定样品取样量为0.2g时，加入40mL萃取溶剂能够达到相对完全的萃取效果，因此本实验样品量选0.2g，萃取溶剂体积选40mL。图5萃取溶剂体积的选择3.5振荡萃取时间的选择对同一样品分别振荡萃取0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5和4h进行比较，结果如图4所示。结果表明，振荡萃取2.0h以后，四种甾醇的萃取效率均达到稳定。最终选择萃取时间2.0h。图6不同振荡萃取时间的萃取效率（μg/g）3.6离子源和电离方式的选择在液质连用中最常用的两种接口方式就是APCI源和ESI源,ESI主要用于极性、大分子有机物，APCI一般用于弱极性、小分子有机物。文献报道的甾醇分析方法既有用ESI源，又有用APCI源。为了获取胡萝卜甙、麦角甾醇、胆甾醇、β－谷甾醇和豆甾醇等五种甾醇和6-酮胆甾烷醇内标的离子对，采用针泵进样，分别比较了ESI源和APCI源在正离子和负离子模式下的电离情况。结果发现，无论是加乙酸铵，还是通过甲酸或乙酸进行酸化，甾醇和内标都没有分子离子峰产生。表4列出了ESI源和APCI源正离子模式下获得的离子碎片，甾醇的质谱图见附录。对于胡萝卜甙、麦角甾醇、胆甾醇、β－谷甾醇和豆甾醇等不饱和甾醇，脱水[M+H-H2O]+是响应最强的离子片段，而对于6-酮胆甾烷醇，[M+H]+是信号比较强的离子碎片。表4植物甾醇的离子碎片物质分子量[M+H-H2O]+[M+H-2H]+[M+H]+[Aglycone+H-H2O]+胡萝卜甙576.85397.5麦角甾醇396.63379.5395.3胆甾醇386.64369.3385.4β－谷甾醇412.69397.5413.2豆甾醇414.69395.5411.46-酮胆甾烷醇402.65385.3400.7403.4固定其它条件不变，比较了ESI离子源和APCI离子源对烟草中植物甾醇的离子化效果。结果如图7所示，APCI相对于ESI来说，选择性较好，基质干扰小，且信噪比低，说明甾醇属于小极性化合物，一般情况下不容易电离，需要通过电晕针放点使其带电。故测定时选择APCI源来进行离子化。图7APCI源与ESI源的比较3.7液相色谱流动相的选择对同一样品分别考察了流动相A相为甲醇、乙腈；B相为水、乙酸铵水溶液、乙酸水溶液对实验结果的影响。如图8所示流动相A为甲醇，流动相B为水的体系甾醇的响应值最高。实验结果也表明在使用APCI源，电喷雾要求较低的挥发性缓冲盐，在流动相中加入乙酸铵、乙酸，抑制甾醇的有效地挥发，使甾醇的响应信号降低。为了提高甾醇的响应度，故选择甲醇-水体系作为流动相。图8不同浓度流动相与响应值(a:6-酮胆甾烷醇；b:胡萝卜甙;c:胆甾醇；d:豆甾醇；e:β-谷甾醇)(1)甲醇-水体系（2）甲醇-乙酸水体系（3）甲醇-乙酸铵水体系3.8进样量的选择APCI源要求较高流速才可以有更好的离子化效果，如果流速过低电晕针放电无法电离出足够的电子或者质子与样品分子发生反应，导致灵敏度降低。用UPLC-MS/MS对同一样品分别选取了5和10µL2个进样量进行分析比较，结果如图9所示。实验表明，色谱峰响应值会随着进样量的增加而增加，但随着进样量的增加，色谱峰明显展宽。因此，选择5µL进样量。图9样品不同进样量与响应值的TIC图（1）5µL进样量；（2）10µL进样量；3.9色谱柱温的选择分别选取了30、40、50和60℃的柱温对甾醇的标准溶液样品进行分析，如图10所示。结果比较发现，温度条件的差异对五种甾醇和内标的影响不大，40℃时响应值稍高，故选择40℃作为色谱分析柱温。图10不同的柱温与响应值3.10前处理后样品的稳定性分别采用白肋烟、香料烟、烤烟、混合型卷烟、烤烟型卷烟等五种不同类型样品考察了处理后样品的稳定性。将前处理后的样品密闭于色谱小瓶中，4℃冷藏保存，分别在当天和2、3、4、5天五个时间点进样。从表5的结果可见，随着时间的增加，甾醇含量不是很稳定。为保证数据的准确性，建议当天处理好的样品当天进样。表5放置时间与样品稳定性样品天数胡萝卜甙麦角甾醇胆甾醇豆甾醇β-谷甾醇香料烟1384.697.20118.94311.42184.242351.3210.11106.97393.47206.993429.839.96116.00391.61195.804398.439.15122.28315.15159.815445.537.63115.01268.53170.26RSD%9.27%15.14%4.93%16.29%10.35%烤烟1288.83——91.01375.11177.662299.73——103.18402.16205.273294.28——101.18351.67179.844272.48——108.99528.40178.385354.22——107.36400.36190.74RSD%10.26%——6.91%16.65%6.34%白肋烟1241.5520.87143.96578.87204.832268.6024.54154.98621.32200.973197.1020.68143.57590.45174.884229.9523.00145.31561.51176.235222.2222.42147.25696.58186.86RSD%11.30%7.16%3.18%8.73%7.31%混合型卷烟1257.76.——122.39452.51172.792238.66——108.83364.68155.423253.94——111.69414.32169.934299.76——132.32582.34161.535215.75——110.36420.05156.75RSD%12.18%——8.57%18.36%4.77%烤烟型卷烟1264.82——91.55287.01145.872254.94——95.73326.98156.583266.80——89.55312.44133.704268.77——106.99377.84151.865260.87——95.37336.42132.06RSD%2.08%——7.05%12.02%7.55%3.11标准曲线和检测限以甲醇:二氯甲烷（19:1）作为溶剂，配制一系列标准溶液，采用内标法得到的5种植物甾醇的工作曲线线性良好，曲线参数和方法指标如表6所示。其中检出限和定量限分别取最低浓度标准溶液连续10次进样，计算测定结果的标准偏差，由3倍和10倍的标准偏差得到。表65种甾醇的标准曲线方程和定量限、检出限分析物回归方程相关系数r检出限μg/g定量限μg/g胡萝卜甙Y=0.134x-0.07220.99993.2610.86麦角甾醇Y=0.134x+0.004410.99992.799.29胆甾醇Y=0.295x-0.4270.99942.909.65豆甾醇Y=0.063x-0.01210.99982.357.82β－谷甾醇Y=0.149x-0.01480.99972.247.463.12精密度和重复性为了考察方法的精密度，对同一样品进行5次日内重复测定，结果如表7所示。结果表明，5种甾醇日内测定结果的相对标准偏差在2.87~9.84%之间，方法的精密度较好。表7方法的日内重复性结果（μg/g）次数胡萝卜甙麦角甾醇胆甾醇豆甾醇β－谷甾醇1363.648.21101.63262.94199.532337.536.75106.85290.91195.803382.288.41109.28322.61192.074359.917.59108.16341.26216.325376.698.09108.53305.83179.95平均值364.017.81106.89304.71196.74RSD4.78%8.51%2.87%9.84%6.70%采用所建立的检测方法对同一个烟叶样品进行了5天的重复实验，结果见表8。结果表明，5种甾醇日间测定结果的相对标准偏差分别在3.81~9.05%之间，方法的日间重现性较好。表8方法的日间重复性结果（μg/g）天数胡萝卜甙麦角甾醇胆甾醇豆甾醇β－谷甾醇1343.129.68108.34373.21187.492412.1210.25113.38353.29194.503371.1010.93113.94318.52192.744326.349.15122.28324.41185.285354.318.97110.21337.68176.45平均值361.409.80113.63341.42187.29RSD%9.058.254.716.523.813.13方法的回收率选取了白肋烟、香料烟、烤烟、混合型卷烟、烤烟型卷烟五种类型的烟叶或烟叶制品样品，分别进行了高、中、低三个水平的加标回收率实验，测定结果列于表9。回收率的均在90%以上。方法回收率较高。表9加标回收实验结果(添加量μg/g)样品胡萝卜甙麦角甾醇胆甾醇豆甾醇β-谷甾醇添加量回收率%添加量回收率%添加量回收率%添加量回收率%添加量回收率%白肋烟185.6291.3%27.6396.7%40.94111.4%208.42106.0%56.63108.2%281.32107.3%55.8494.5%62.0591.3%315.8895.0%114.4494.2%372.88109.7%83.2796.6%82.2493.6%418.6997.5%170.6491.1%香料烟186.44100.7%27.7591.5%41.1292.6%209.3597.3%56.88100.3%261.6492.0%51.9497.1%57.71101.8%293.7992.9%106.4391.4%363.0692.6%81.0792.2%80.08100.6%407.6693.7%166.15117.6%烤烟185.62104.5%26.5899.9%39.3894.6%200.4793.2%54.4799.4%281.32113.5%55.8494.3%62.05100.5%315.8890.5%114.4491.0%372.88119.2%83.194.6%82.0898.8%417.87106.2%170.31119.8%混合型卷烟177.2897.8%26.3998.9%39.1104.0%199.0690.6%54.09119.2%265.6891.6%52.7492.1%58.691.8%298.3294.6%108.07107.7%372.1594.0%83.1119.3%82.08101.0%417.8790.1%170.3197.6%烤烟型卷烟181.0199.3%26.9490.5%39.9290.8%203.25106.3%55.22104.0%269.58109.2%53.5193.3%59.46102.9%302.791.4%109.6691.0%367.9998.2%82.1796.9%81.1791.8%413.293.8%168.4196.0%3.14共同实验结果本项目开展了对比试验，选择了香料烟、白肋烟、烤烟、烤烟型卷烟、混合型卷烟5种类型的卷烟进行分析。选取了云南烟草科学研究院、红塔集团、红云红河集团、国家烟草质量监督检验中心、广东中烟、江苏中烟等6家实验室进行了比对实验，实验结果如表10-表14所示。表10胡萝卜甙共同实验结果（μg/g）序号样品云南院红塔红云质检中心广东江苏均值RSD1香料烟462.91455.01445.10448.88460.85452.87454.271.50%2白肋烟322.77321.79317.43298.80312.90298.95312.113.47%3烤烟359.48338.78317.46332.02330.04339.92336.284.14%4烤烟型卷烟354.28359.51332.51327.29318.72320.60335.495.18%5混合型卷烟340.47335.61340.92318.85322.67351.31334.973.64%表11麦角甾醇共同实验结果（μg/g）序号样品云南院红塔红云质检中心广东江苏均值RSD1香料烟10.249.8711.569.6210.1710.2810.296.53%2白肋烟26.5324.9924.1623.1122.4832.4724.5914.23%3烤烟————————4烤烟型卷烟————————5混合型卷烟————————表12胆甾醇共同实验结果（μg/g）序号样品云南院红塔红云质检中心广东江苏均值RSD1香料烟62.3176.0166.9774.1066.3463.7168.248.18%2白肋烟121.39135.74122.38125.90121.12124.50125.174.39%3烤烟63.1665.1663.1063.6461.2662.0663.062.13%4烤烟型卷烟60.7663.0161.5560.7361.4161.7861.541.36%5混合型卷烟61.7265.1168.6967.0678.6484.3470.9312.26%表13豆甾醇共同实验结果（μg/g）序号样品云南院红塔红云质检中心广东江苏均值RSD1香料烟324.86310.02316.89349.72325.72327.03325.714.13%2白肋烟521.91592.88600.00579.68599.60573.71577.965.10%3烤烟395.23394.37409.14419.48401.19446.10410.924.78%4烤烟型卷烟374.07370.61342.40345.12335.81356.44354.084.43%5混合型卷烟412.59410.45430.06452.51446.78426.27429.784.01%表14β－谷甾醇共同实验结果（μg/g）序号样品云南院红塔红云质检中心广东江苏均值RSD1香料烟195.91189.98199.80181.93197.91184.74191.713.82%2白肋烟204.48185.28191.63171.85191.63181.27187.695.89%3烤烟202.38189.67192.66173.16181.41179.25186.425.66%4烤烟型卷烟139.67147.56152.00128.81130.98132.39138.576.87%5混合型卷烟136.37133.77130.36129.07133.21142.24134.173.52%由表10-表14所示的结果可见，6家实验室实验结果的RSD除了2个为14.23%、12.26%之外，均小于10%，说明各家实验室结果较为接近，再现性好。3.15实际样品的测定结果采用优化后的检测方法对27个样品进行了测定，其中复烤烟叶样品18个，卷烟样品9个。测定结果见表15。表15实际样品测定结果（μg/g）样品胡萝卜甙麦角甾醇胆甾醇豆甾醇β－谷甾醇1#177.9796.93363.9894.252#202.0796.72352.33119.693#201.76112.24442.70136.344#238.00118.40506.00137.605#256.9699.70424.84127.286#287.78105.58424.01136.917#199.51113.06352.08115.408#239.04100.24285.30135.909#78.8064.24102.4641.8610#202.2692.60257.42118.6811#101.3284.43216.0751.9312#410.569.69165.02669.66175.5913#272.947.28114.15379.90113.2314#214.9710.56150.29633.4082.7315#403.037.81170.29556.29249.7616#333.338.02156.23487.18151.1017#251.5094.31288.49148.6818#282.6688.33334.73119.3919#240.41104.67321.78123.9020#415.7888.17365.66239.4421#227.50101.88354.10115.5322#299.90107.25387.29157.8923#278.9181.94273.71168.0424#328.47125.17344.02181.1525#299.6987.03301.48129.9226#334.757.57109.50323.40164.3527#229.9719.79135.91565.50177.57图11典型混标总离子流图1、6-酮胆甾烷醇；2、胡萝卜甙；3、麦角甾醇；4、胆甾醇；5、豆甾醇；6、β－谷甾醇 图12典型混标提取离子流图1、6-酮胆甾烷醇；2、胡萝卜甙；3、麦角甾醇；4、胆甾醇；5、豆甾醇；6、β－谷甾醇图13典型样品的总离子流图1、6-酮胆甾烷醇；2、胡萝卜甙；3、麦角甾醇；4、胆甾醇；5、豆甾醇；6、β－谷甾醇图14典型样品的提取离子流图1、6-酮胆甾烷醇；2、胡萝卜甙；3、麦角甾醇；4、胆甾醇；5、豆甾醇；6、β－谷甾醇图15麦角甾醇二级质谱图(母离子379.5)图16胆甾醇二级质谱图(母离子369.3)图17豆甾醇二级质谱图(母离子395.5)图18β－谷甾醇二级质谱图(母离子397.5) 图19胡萝卜甙二级质谱图(母离子397.5)图206-酮胆甾烷醇二级质谱图(母离子403.4)参考文献：[1]LenaNormen,SusanneBryngelsson,MonicaJohnsson.ThePhytosterolContentofSomeCerealFoodsCommonlyConsumedinSwedenandintheNetherlands[J].JOURNALOFFOODCOMPOSITIONANDANALYSIS,2002,15:693-704.[2]IrwinS,AnnelideP,HoffmannD．Phytosterolsintobacco：Quantitativeanalysisandfateintobaccocombustion[J]．BeitrfigezurTabakforSchuninternational.1975,8：211-218．[3]StedmanRL.Chemicalcompositionoftobaccoandtobaccosmoke[J].Chem.Rew.,1968,68l:53-207．[4]LiuWH,DingB,RuanXM，eta1.Analysisoffreeandconjugatedphytosterolsintobaccobyanimprovedmethodusinggaschromatography-flameionizationdetection[J].J.Chromatogr.A．2007,1163:304-311．[5]KovgankoNV,KashkanZN.Sterolglycosidesandacylglycosides[J]．Chem．Nat．Comp．1999,35：479-497．[6]左天觉．烟草的生产、生理和生物化学．上海远东出版社．1993．419—422．[7]SchepartzAI，EllingtonJJ，SehlotzhauerWS．Destructionofprecursorsofpolynucleararomatichydrocarbonsintobaccobytreatmentwithozone[J]．TohSci，1980，56：55-58．[8]FreudenthalRI，JonesPW.Carcinogenesis[M].NewYork：RavenPress，1976：225．[9]Schmeltz，HoffnlannD．Carcinogenesis，inFreudenthalRIandJonesPW(Editors),RaVenPress，NewYork，l976,225—230[10]Scholtzhauer，W.S，；SeVerson，R．F．；Chortyk，O．T．；Arrendale，R．F．；Higman，H．CPyrolyticfomationofpolynucleararomatichydrocarbonsfrompetroleumetherextractableconstituentsofflue．curedtobaccoleaf.J．Agric．FoodChem．1976，24，992—997．[11]Britt，P．F．；Buchanan，A．C．；Kidder，M．K．；Owens，C．V．Influenceofsteroidstructureonthepyrolyticformationofpolycyclicaromatichydrocarbons．J．Anal．App1．Pyro1．2003，66，7l-95．[12]Johnstone,R.A.W．；Plimmer,J.R．TheChemicalConstituentsofTobaccoAndTobaccoSmoke．Chem.Rev.1959，59，885-936[13]Bindler,G.N．；Piade,J.J．；Schulthess,D.EVaIuationofselectedstero