泡盛曲霉来源-β-1-3-1-4葡聚糖酶的纯化、性质及应用研究

泡盛曲霉来源β-1,3-1,4葡聚糖酶的纯化、性质及应用研究学生：刘二伟指导老师：朱文学教授

日期：2016.11.122014级研究生开题报告汇报内容1、实验方法2、实验结果3、下一步实验计划1、实验方法产β-葡聚糖酶菌株的确定及鉴定液体发酵条件优化摇瓶复筛平板初筛β-葡聚糖酶的纯化β-葡聚糖酶的酶学性质β-葡聚糖酶的应用研究实验路线图2、实验结果2.1泡盛曲霉CAU33的分离与鉴定2.2泡盛曲霉CAU33产β-1,3-1,4葡聚糖酶

液体发酵条件优化2.2.1碳源对液体发酵产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的影响碳源β-1,3-1,4-葡聚糖酶酶活力（U/mL）可溶性淀粉41.5±0.9稻草541.5±22.9玉米杆257.7±17.8玉米芯755.7±52.2小麦麸皮582.1±11.7燕麦粉453.7±16.6葡萄糖28.8±5.3青稞粉681.1±5.32.2.2氮源对液体发酵产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的影响氮源种类β-1,3-1,4-葡聚糖酶酶活力（U/mL）酵母提取物1817±65胰蛋白胨1896±40酵母提取物：胰蛋白胨=1:12161±51蛋白胨1758±63牛肉蛋白胨2220±84大豆蛋白胨2406±113乙酸铵864±87(NH4)2SO4731±83(NH4)2HPO4457±472.2.3表面活性剂对液体发酵产β-1,3-1,4-

葡聚糖酶的影响表面活性剂β-1,3-1,4-葡聚糖酶酶活力

（U/mL）02468±72吐温

202736±56吐温

402882±105吐温

603105±163吐温

803269±61曲拉通

X-1103629±105曲拉通

X-1144071±1592.2.4初始pH和发酵温度对液体发酵产

β-1,3-1,4-葡聚糖酶的影响2.2.5发酵时间对液体发酵产β-1,3-1,4-

葡聚糖酶的影响2.2.5响应面法优（CCD）化液体发酵产

β-1,3-1,4-葡聚糖酶试验号因素酶活(U/mL)A-玉米芯B-大豆蛋白胨C-曲拉通X-114观测值拟合值100-233983709.19200077107728.52300076097728.52400079517728.525-11-161735871.62620069507402.94711181947750.8781-1-164496037.3791-1164846600.241000073007728.5211-11169847210.491211-172686915.4913-20056335365.1914-1-1154395606.3715-1-1-142824533.991600257375610.941700078647728.521800077527728.521902073927734.69200-2054105252.44中心复合设计(CCD)响应面设计及实验结果各因素的估计回归系数项自由度平方和均方FPr>F模型930124017.573347113.0621.75123218<0.0001A14152425.0634152425.0626.984556530.0004B16161565.0636161565.0640.04096359<0.0001C13616653.0633616653.0623.502839310.0007AB1102831.125102831.1250.6682486170.4327AC1126756.125126756.1250.8237253580.3854BC137128.12537128.1250.2412773190.6339A212840448.3252840448.3218.458668660.0016B212396605.7182396605.7215.57435510.0027C2114795649.4714795649.596.14960738<0.0001剩余101538815.381153881.538失拟51277866.047255573.2094.8969891240.0530回归5260949.333352189.8667总和1931662832.95

经回归拟合后，酶活的预测值Y可以用以下回三元二次归方程表示：Y=7728.52+509.44*A+620.56*B+475.44*C-113.37*A*B-125.87*A*C+68.13*B*C-336.11*A2-308.74*B2-767.11*C2R2=95.14%，二次方程的拟合度高，自变量与响应值之间线性关系显著，说明此模型预测结果比较准确。各因素对β-1,3-1,4葡聚糖酶产量影响的响应面图和等高图

优化后培养基配方为：玉米芯55g/L、大豆蛋白胨25g/L、曲拉通X-11423g/L，测定酶活力为8446.93U/mL，比优化前提高了17.6倍，且与预测值相近，误差为2.6%，2.3泡盛曲霉CAU33β-1,3-1,4-葡聚糖酶的纯化纯化步骤总酶活力(U)总蛋白(mg)比活（U/mg）纯化倍数(fold)回收率（%）粗酶液288729020161432.191100硫酸铵沉淀（60-90%）2142446784.82729.941.974.2Q-Sepharosefastflow（pH8.0）77294071.410825.497.626.7DE52（pH7.0）63809042.315084.869.122.1泡盛曲霉CAU33β-1,3-1,4-葡聚糖酶纯化表凝胶层析法测定分子量，测定其分子量为27.6kDa。纯化电泳图2.3.1泡盛曲霉CAU33β-1,3-1,4-葡聚糖酶

最适pH及pH稳定性2.3.2泡盛曲霉CAU33β-1,3-1,4-葡聚糖酶

最适温度及温度稳定性

该酶在45℃，50℃，55℃，60℃，65℃的半衰期分别为277min，200min，57min，32min，26min。2.3.3金属离子及化合物对泡盛曲霉CAU33β-1,3-1,4-葡聚糖酶的影响金属离子及化合物相对酶活力（%）比酶活力（Umg-1）Control10015,345±375Cu2+108.316,618±283Ca2+9113,963±149Ni2+111.117,048±591Mg2+120.618506±358Zn2+110.516,956±476Mn2+8613,196±543Co2+109.816,848±173Na+101.715,605±182Ba2+80.112,291±318Hg2+15.12,317±101Fe2+94.214,454±122Fe3+112.717,293±173Cr3+114.617,585±235Sn2+141.921,774±146Li+112.717,294±402K+106.416,327±224SDS84.813,012±236DTT95.714,685±1892.3.4泡盛曲霉CAU33β-1,3-1,4-葡聚糖酶的底物特异性2.3.5泡盛曲霉CAU33β-1,3-1,4-葡聚糖酶在

麦芽糖化中的应用

酶添加量过滤时间过滤时间降低粘度粘度降低（U/g麦芽）（s）百分比(%)(cP)百分比(%)01500-1.599-2014155.671.5761.49