诺如病毒实时定量PCR检测及质量控制

诺如病毒荧光定量RT-PCR检测技术

及其质量控制山东省疾病预防控制中心病原微生物所张文强

一、诺如病毒简介二、实时定量PCR原理三、诺如病毒实时定量RT-PCR四、质量控制目录诺如病毒简介1940s,胃肠炎粪便过滤,接种，志愿者发病1968年,美国，诺瓦克镇小学暴发急性胃肠炎1972年，电镜，诺瓦克病毒/小圆结构病毒1992年，全基因组序列，杯状病毒科2002年8月，ICTV,诺如病毒历史诺如病毒基因组结构和编码蛋白诺如病毒的结构诺如病毒进化快抗原变异重组引起人类腹泻的主要是GⅠ和GⅡ聚合酶区分类实时定量PCR原理PCR-体外模拟人体DNA复制PCR循环、扩增在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的累积，实时监测整个PCR进程，对起始模板进行定量分析。实时定量PCR-起点定量，“天然”普通PCR技术-终点定量，“加工”

实时定量PCR荧光扩增曲线-不是严格遵从2n扩增终点定量失真基线：扩增曲线最初数个循环里，直线区域基线阈值

Ct值[DNA]0阈值：人为设定，基线荧光标准偏差的10倍Ct值：荧光信号到达域值时所经历的循环数基线

阈值

Ct值

[DNA]0Ct值-起始DNA量数的对数：线性关系基线

阈值

Ct值

[DNA]0Ct值[DNA]0，Why？Ct值[DNA]0，Why？诺如病毒实时定量RT-PCR诺如病毒检测方法人工合成的寡核苷酸链5'端标记有荧光报告基团（Reporter，R）3'端标记有荧光淬灭基团（Quencher，Q）与目标序列互补TaqMan探针

新DNA链切断探针荧光信号荧光信号的累计与PCR产物形成完全同步TaqMan探针反应原理优点：特异性高，可用于多重PCR体系缺点：成本高，设计困难，多重PCR探针的选择双重检测，ORF1-ORF2交界区引物和探针

反应体系热循环程序

Genogroup（G）引物/探针序列（5'to3'）工作浓度GICog1FCGYTGGATGCGITTYCATGA400nMCog1RCTTAGACGCCATCATCATTYAC400nMprobeRing1EFAM–TGGACAGGRGAYCGC–MGBNFQ200nMGIICog2FCARGARBCNATGTTYAGRTGGATGAG400nMCog2RTCGACGCCATCTTCATTCACA400nMprobeRing2Cy5–TGGGAGGGCGATCGCAATCT–BHQ2200nM组分体积（μL）终浓度2×RT-PCRbuffer12.51×Cog1F（50μM）0.2400nMCog1R（50μM）0.2400nMprobeRing1E（50μM）0.1200nMCog2F（50μM）0.2400nMCog2R（50μM）0.2400nMprobeRing2（50μM）0.1200nM25×RT-PCRenzyme11×RNase-freewater7.5

引物和探针

反应体系热循环程序

循环数温度时间145℃10min195℃10min45×95℃15S60℃1min引物和探针

反应体系热循环程序

诺如病毒检测流程实时定量PCR操作流程阴性对照：无扩增，NoCt病毒模板对照：有扩增，曲线与阈值交叉样本：阳性Ct≤40结果说明质量控制人数专业素养延续性仪器的熟练使用人员试剂仪器样本处理室核酸提取室体系配置室加样室PCR室实验室分区采集对象：病例重点人群水/食物/环境标本类型：粪便，5g以上采集时间：标本应在发病5日内采集标本保存：短期4℃

长期-20℃或-80摄氏度标本运输：冷藏或冷冻标本采集专门的房间RNA酶去除剂操作轻柔PE手套塑料垫消毒剂阴性对照密封的大便盒

标本处理试剂的效期专门的房间RNA酶去除剂加样轻柔阴性对照

核酸提取试剂的效期专门的房间RNA酶去除剂试剂冰浴MasterMix，分装阴性对照体系配置标本-枪头-反应孔阳性对照最后加尽量少碰触管帽离心加样荧光PCR产物上机基线阈值阴性对照、阳性对照Excel电子表格、Excel公式结果分析标准曲线好的标准曲线：平行样本曲线聚集；间隔均匀；S型曲线CT值在预定范围内；Eff在90%~100%间；R2＞0.98差的标准曲线：平行样本一致性差；间隔不均匀；CT值超出预定范围内；Eff>110%IPC，人工合成的核苷酸序列，Ct：32-38降低假阴性结果内部阳性质控（IPC）PCR抑制，病毒阴性W1230028：加样量15ul，J