核“芯”13-PCR技术及应用

核“芯”13PCR技术及应用(时间：20分钟)1.(2021·东北三校联考)奶牛体内含有溶菌酶基因(Lyz)，但表达水平较低。研究人员试图通过替换启动子的方法，实现Lyz基因在奶牛乳腺细胞中的高效表达。回答下列问题：(1)溶菌酶可破坏细菌的________，导致细菌过度吸水破裂而死亡；与使用抗生素相比，利用溶菌酶杀菌具有________________________________(至少答出两点)等优点。(2)从奶牛乳腺上皮细胞提取总RNA，经________获得cDNA，以cDNA为模板进行PCR扩增，需要加入Lyz基因的________种引物。PCR扩增的前提是要根据________________________设计引物，引物与母链结合后控制不同温度进行反复循环。(3)对Lyz基因片段和带有绿色荧光蛋白基因的质粒进行连接，构建重组质粒。重组质粒中绿色荧光蛋白基因的作用是作为________基因。为保证Lyz基因在奶牛乳腺细胞中高效表达，可用________的启动子替换原有启动子。将重组质粒转入奶牛乳腺细胞，再利用荧光显微镜检测奶牛乳腺细胞中______________________，来判断奶牛Lyz基因乳腺特异性表达质粒是否构建成功。答案(1)细胞壁无毒、无害、无残留、抗菌范围广、安全性高、不产生抗药性等(答出两点即可)(2)反转录两一段已知目的基因的核苷酸序列(3)标记乳腺蛋白基因是否有绿色荧光解析(1)溶菌酶可通过分解细菌的细胞壁来杀死细菌；与抗生素相比，溶菌酶具有无毒、无害、无残留、抗菌范围广、安全性高、不产生抗药性等优点。(2)以RNA为模板，经反转录可获得cDNA，要通过PCR技术获得大量的Lyz基因，需要在进行PCR时，加入Lyz基因的两种引物；PCR扩增的前提是要根据一段已知目的基因的核苷酸序列设计引物，引物与母链结合后控制不同温度进行反复循环。(3)基因表达载体中含有启动子、目的基因、终止子、标记基因和复制原点，其中标记基因的作用是鉴别受体细胞中是否含有目的基因，如抗生素抗性基因、荧光蛋白基因等可作为标记基因。为保证Lyz基因在奶牛乳腺细胞中高效表达，需要用乳腺蛋白基因的启动子替换原有启动子。由于乳腺蛋白只在乳腺细胞中表达，所以如果奶牛Lyz基因乳腺特异性表达质粒构建成功，则会在奶牛乳腺细胞中观察到绿色荧光标记。2.(2021·武汉市调研)科学研究表明，新冠病毒是一种单链RNA病毒，其通过刺突蛋白(S蛋白)与人的ACE2受体识别结合，感染人的呼吸道上皮细胞。请回答下列问题：(1)获取病毒RNA后，通过________过程得到cDNA，再利用PCR技术扩增S蛋白基因，扩增前要根据一段目的基因的核苷酸序列合成引物，PCR过程中需要引物的原因是____________________________________________________________________________________________________________________________。(2)科学家利用S蛋白刺激实验动物的免疫系统，获取________，用于新冠病毒的检测及筛查。(3)将重组质粒导入受体细胞后，首先要检测____________________________________________________________________________________________________，这是目的基因能否在受体细胞中稳定遗传的关键。常采用DNA分子杂交技术进行检测，即在含有目的基因的DNA片段上用________等作标记，以此作为探针来检测。(4)用荧光探针检测目的基因时，先将探针与染色体共同煮沸，使DNA双链中的________断裂，形成单链。随后在降温复性过程中，探针的碱基依据________原则，与染色体上的特定基因序列形成较稳定的杂交分子。两条姐妹染色单体中最多可有________条荧光标记的DNA片段。答案(1)逆转录DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3′端延伸DNA链(合理即可)(2)抗体(3)转基因生物的DNA上是否插入了目的基因放射性同位素(4)氢键碱基互补配对4解析(1)获取病毒的RNA后，通过逆转录过程得到cDNA，再利用PCR技术扩增S蛋白基因。由于DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链，不能从头开始合成DNA，故利用PCR技术扩增S蛋白基因前要根据一段目的基因的核苷酸序列合成引物。(2)利用S蛋白刺激实验动物的免疫系统，可获取特异性抗体，然后利用抗体能够和抗原特异性结合的特点，进行新冠病毒的检测及筛查。(3)将重组质粒导入受体细胞后，首先要检测转基因生物的DNA上是否插入了目的基因，这是目的基因能否在受体细胞中稳定遗传的关键。常采用DNA分子杂交技术进行检测，即在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素等作标记，以此作为探针来进行检测。(4)将探针与染色体共同煮沸会使DNA双链中的氢键断裂，形成单链DNA分子。随后在降温复性过程中，探针的碱基可依据碱基互补配对原则与染色体上的特定基因序列形成较稳定的杂交分子。两条姐妹染色单体中最多含有两个目的基因、四条DNA单链，最多可有4条荧光标记的DNA片段。3.(2021·南昌市模拟)人乳铁蛋白是乳汁中一种重要的糖蛋白。乳铁蛋白不仅可参与铁的转运，而且还具有广谱抗菌、抗氧化、抗癌、调节免疫系统等强大生物功能。如图是培育表达人乳铁蛋白的乳腺生物反应器的过程。图中Tetr表示四环素抗性基因，Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，图中标注了BamHⅠ、HindⅢ、SmaⅠ三种限制酶的酶切位点。据图回答：(1)若用PCR技术扩增人乳铁蛋白基因，其前提条件是有一段________，以便合成相应的引物，合成的引物能与待扩增区段________(填“中间”“两端”“左端”或“右端”)的DNA序列互补配对。(2)图中将人乳铁蛋白基因插入载体，需用________限制酶同时切割载体和人乳铁蛋白基因。筛选含有重组载体的大肠杆菌时，首先需要在含________的培养基上进行。经过两种培养基培养后再从________(填字母)处挑出大肠杆菌，扩增带有外源DNA的重组载体。为使人乳铁蛋白基因在牛的乳腺细胞中特异性表达，应在基因的上游插入________。(3)过程②的代孕牛需要进行________处理。若需获得多头转基因牛，可对早期胚胎进行分割，对囊胚阶段的胚胎进行分割时需要注意________。(4)为检测转基因牛的乳汁中是否含有人乳铁蛋白，可采用________技术。答案(1)已知的人乳铁蛋白基因(目的基因)的核苷酸序列两端(2)HindⅢ和BamHⅠ氨苄青霉素D牛乳腺蛋白基因的启动子等调控组件(3)同期发情将内细胞团均等分割(4)抗原—抗体杂交解析(1)利用PCR技术扩增目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这段序列合成引物，合成的引物能与待扩增区段两端的DNA序列互补配对。(2)分析题图，若用SmaⅠ切割人乳铁蛋白基因，会使其遭到破坏，需要用限制酶BamHⅠ和HindⅢ同时切割载体和人乳铁蛋白基因(目的基因)。用限制酶BamHⅠ、HindⅢ切割载体时会破坏Tetr基因，而Ampr基因不会被破坏，因此筛选含有重组载体的大肠杆菌时，首先需要在含有氨苄青霉素的培养基中进行，在该培养基上能生存的大肠杆菌有两种：含有重组载体的大肠杆菌、含有未导入目的基因的载体的大肠杆菌，再采用影印法，在含有四环素的Tet琼脂平板上进行筛选，图中B处无菌落，说明与此位置对应的Amp琼脂平板上D处生长的菌落是导入重组载体的大肠杆菌。要使人乳铁蛋白基因在牛的乳腺细胞中特异性表达，需在目的基因的上游插入牛乳腺蛋白基因的启动子等调控组件。(3)过程②为胚胎移植，胚胎移植前需对代孕牛进行同期发情处理。在对囊胚阶段的胚胎进行分割时，需要注意将内细胞团均等分割，否则会影响分割后胚胎的恢复和进一步发育。(4)检测转基因牛的乳汁中是否含有人乳铁蛋白，可采用抗原—抗体杂交技术。4.(2021·河南开封市模拟)如图表示某植物的多种育种流程，请回答下列有关问题：(1)图1中，培育子代Ⅱ和子代Ⅲ所用育种方法的原理________(填“相同”或“不相同”)。(2)图1中，欲从子代Ⅲ中选育显性纯合个体需________，培育子代V的过程中发生了________(填变异类型)。(3)图2中，利用PCR技术扩增目的基因前，需先获得供体细胞的________。为了便于扩增的DNA片段与表达载体连接，需在引物的5′端(见图3)加上限制酶酶切位点，且常在两条引物上设计加入不同的限制酶酶切位点，主要目的是__________________________________________________________________________________________________________________________________________。图3答案(1)相同(2)