2024-2025学年高中生物专题五DNA和蛋白质技术课题3血红蛋白的提取与分离学案新人教版选修1

PAGE8-课题3血红蛋白的提取与分别学习目标课程标准1．驾驭提取生物大分子的基本过程和方法。(重点)2．理解凝胶色谱法、电泳法等分别生物大分子的基本原理。(重、难点)3．尝试对血液中的血红蛋白进行提取和分别。尝试蛋白质的提取与分别自主学习·预习热身一、凝胶色谱法1．概念：也称做__安排色谱法__，是依据__相对分子质量大小__分别蛋白质的有效方法。2．原理当__相对分子质量__不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量__较小__的蛋白质简洁进入凝胶内部的通道，路程__较大__，移动速度__较慢__，而相对分子质量__较大__的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在__凝胶外部__移动，路程__短__，移动速度__快__，从而使__相对分子质量__不同的蛋白质分子得以分别。二、缓冲溶液1．作用：在肯定范围内，抵制__外界__的__酸和碱__对溶液pH的影响，维持pH__相对稳定__。2．配制：由__1～2__种缓冲剂溶解于__水__中配制而成，通过调整缓冲剂的__运用比例__就可以得到不同pH范围内运用的缓冲液。三、电泳1．概念：指__带电粒子__在电场的作用下发生的__迁移__的过程。2．原理：在肯定的__pH__下，__多肽__、__核酸__等生物大分子的可解离基团会带上__正电__或__负电__，在__电场__的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷__相反__的电极移动。3．作用：电泳利用了待分别样品中各种分子__带电性质__的差异及分子本身的__大小__、__形态__的不同，使带电分子产生不同的__迁移速度__，从而实现样品中__各种分子__的分别。4．方法：常用的电泳方法有__琼脂糖凝胶电泳__和__聚丙烯酰胺凝胶电泳__。测定蛋白质分子量时通常运用__SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳__。四、试验操作蛋白质的提取和分别一般分为四步：__样品处理__、__粗分别__、__纯化__和__纯度鉴定__。1．样品处理(1)红细胞的洗涤：目的是__去除杂蛋白__。采纳__低速短时间__离心，吸取血浆后加__生理盐水__洗涤，直至上清液中没有__黄色__，表明红细胞已洗涤干净。(2)血红蛋白的释放：在__蒸馏水__和__甲苯__的作用下，红细胞裂开，释放出血红蛋白。(3)分别血红蛋白溶液：把混合液离心后，将试管中的液体用滤纸过滤，除去__脂溶性沉淀层__，于分液漏斗中静置片刻后，分别出下层的__红色透亮液体__。(4)透析：透析袋能使小分子自由进出，而将大分子物质保留在袋内。2．凝胶色谱操作(1)凝胶色谱柱的制作：打算材料→加工橡皮塞→安装色谱柱。(2)凝胶色谱柱的装填。(3)样品的加入和洗脱。其基本过程是调整缓冲液面→加入蛋白质样品→调整缓冲液面→洗脱→收集分装蛋白质。至此，血红蛋白即可得到粗分别。3．纯度鉴定：在鉴定的方法中，运用最多的是__SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳__。五、操作提示1．红细胞的洗涤：__洗涤次数__、__离心速度__与__离心时间__非常重要。洗涤次数过少，无法除去__血浆蛋白__；离心速度__过高__和时间__过长__会使__白细胞__等一同沉淀，达不到分别效果。2．色谱柱填料的处理：商品凝胶运用前需干脆放在__洗脱液__中膨胀，可以将加入其中的湿凝胶用__沸水浴加热__，加速膨胀。3．凝胶色谱柱的装填：在装填凝胶柱时，不能有__气泡__存在。因其能搅乱洗脱液中蛋白质的__洗脱次序__，降低分别效果。4．蛋白质的分别：假如__红色区带匀称一样地移动__，说明色谱柱制作胜利。思索红细胞裂开后混合液中含有什么成分？提示：红细胞裂开混合液中不仅含有血红蛋白，而且还含有细胞裂开物、脂质、甲苯等。┃┃活学巧练__■推断题1．相对分子质量较大的蛋白质，无法进入凝胶内部的通道，移动速度较慢。(×)分析：相对分子质量较大的蛋白质，无法进入凝胶内部的通道，移动速度较快。2．在肯定范围内，缓冲溶液能够抵制外界的酸和碱对溶液pH的影响，维持pH基本不变。(√)3．电泳法分别样品只取决于蛋白质的相对分子质量大小。(×)分析：电泳利用了待分别样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形态的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分别。4．红细胞的洗涤是为了彻底除去杂蛋白，应快速离心。(×)分析：红细胞的洗涤目的是除去杂蛋白，离心的目的是使红细胞沉淀，而杂蛋白等均在上清液中，应低速缓慢离心，假如高速离心则会导致白细胞等一起沉淀，起不到分别的效果。5．纯化蛋白质的原理是依据不同蛋白质之间以及蛋白质与其他分子之间存在电荷差异进行的。(×)分析：纯化蛋白质的方法是凝胶色谱法，利用的是不同蛋白质之间以及蛋白质与其他分子之间存在分子大小的差异进行的。6．样品处理和粗分别的目的都是除去相对分子质量较小的杂质。(×)分析：样品处理的目的是除去相对分子质量较大的杂质。7．透析袋是一种选择透过性膜。(√)8．SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳分别蛋白质的依据是蛋白质分子相对分子质量和带电性质的差异。(×)分析：SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳是依据大多数蛋白质都能与阴离子表面活性剂——十二烷基硫酸钠(SDS)按重量比结合成复合物，使蛋白质分子所带的负电荷远远超过自然蛋白质分子的电荷量，消退了不同蛋白质间的电荷差别，使蛋白质分子电泳迁移率完全取决于相对分子质量的大小。新知解读·互动探究学问点血红蛋白提取和分别的方法┃┃要点归纳__■1．依据蛋白质的特性的差异蛋白质的理化性质(如形态、大小、电荷性质和多少、溶解度、吸附性质、亲和力等)千差万别，由此可提取和分别各种蛋白质。2．蛋白质的分别方法：凝胶色谱法(1)概念：凝胶色谱法也称做安排色谱法，是依据相对分子质量大小分别蛋白质的有效方法。(2)原理：大多数凝胶由糖类化合物构成的小球体，内部有很多贯穿的通道，当不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较小的蛋白质简洁进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢；而相对分子量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。3．缓冲溶液(1)作用：在肯定范围内，缓冲溶液能够抵制外界的酸和碱对溶液pH的影响，维持pH基本不变。(2)配制：通常由1～2种缓冲剂溶解于水中配制而成。调整缓冲剂的运用比例就可以制得在不同pH范围内运用的缓冲液。4．电泳(1)概念：带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。(2)原理：很多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在肯定pH下，这些基团会带上正电或负电。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。电泳利用了待分别样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形态的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分别。┃┃典例评析__■典例1分别不同种类的蛋白质依据的原理不包括(D)A．分子的形态和大小B．所带电荷的性质和多少、吸附性质C．对其他分子的亲和力D．蛋白质分子的组成元素[解析]分别不同种类的蛋白质依据的原理包括分子的形态和大小、所带电荷的性质和多少、吸附性质、对其他分子的亲和力和蛋白质分子的溶解度等。蛋白质分子的组成元素不是分别不同蛋白质的依据。┃┃变式训练__■1．利用凝胶色谱法，什么样的蛋白质先洗脱出来(A)A．相对分子质量大的 B．溶解度高的C．相对分子质量小的 D．所带电荷多的[解析]凝胶色谱法是依据相对分子质量的大小分别蛋白质的有效方法。相对分子质量较小的蛋白质能进入凝胶内部通道，路程较长，移动速度较慢；相对分子质量大的蛋白质，路程较短，移动速度较快，首先洗脱出来。学问点提取和分别血红蛋白的试验操作┃┃要点归纳__■蛋白质的提取和分别一般分为四步：样品处理、粗分别、纯化和纯度鉴定。1．样品处理的过程红细胞洗涤eq\b\lc\{(\a\vs4\al\co1(目的：去除杂蛋白,方法：低速短时间离心))↓eq\a\vs4\al\co1(血红蛋白,释放)eq\b\lc\{(\a\vs4\al\co1(将洗涤好的红细胞倒入烧杯中，加蒸馏,水到原血液的体积，再加40%体积的甲苯,置于磁力搅拌器上充分搅拌10min))↓eq\a\vs4\al\co1(分别血红,蛋白溶液)eq\b\lc\{(\a\vs4\al\co1(第一层：无色透亮的甲苯层,其次层：脂溶性物质的沉淀层，白色薄层固体,第三层：血红蛋白的水溶液，红色透亮,第四层：其他杂质的暗红色沉淀物。))↓eq\a\vs4\al\co1(透析)eq\b\lc\{(\a\vs4\al\co1(取1mL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析,袋放入盛有300mL的物质的量浓度为20mmol/L,的磷酸缓冲液中pH为7.0，透析12h。))2．凝胶色谱操作的主要步骤eq\a\vs4\al\co1(凝,胶,色,谱,操,作)eq\b\lc\{(\a\vs4\al\co1(\a\vs4\al(凝胶色谱,柱的装填)\b\lc\{\rc\(\a\vs4\al\co1(\a\vs4\al(用蒸馏水溶胀凝胶→匀称装填入色谱柱→在约50cm,高的操作压下用300mL浓度为20mmol/L的磷酸缓冲,液充分洗涤平衡凝胶12h，使凝胶装填紧密))),,,\a\vs4\al(样品的加,入和洗脱)\b\lc\{(\a\vs4\al\co1(\a\vs4\al(打开流出口：使缓冲液与凝胶面平齐，关闭出口,↓,用吸管将1mL样品加到色谱柱顶端，打开出口，,使样品渗入凝胶床内后，关闭出口,↓,当心加入物质的量浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液到适当,高度后，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口，起先洗脱,↓,待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，,每5mL收集一管，连续收集)))))3．纯度鉴定——SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳推断纯化的蛋白质是否达到要求，须要进行蛋白质纯度的鉴定。鉴定的方法中，运用最多的是SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳。4．结果分析与评价项目分析血液样品的处理①分层明显→样品处理完成eq\a\vs4\al(②分层不明显的缘由)eq\b\lc\{(\a\vs4\al\co1(洗涤次数少，未能除去血浆蛋白,离心速度过高或时间过长))凝胶色谱柱的装填①放一支与凝胶柱垂直的日光灯→干脆检查凝胶是否装填得匀称②加入大分子有色物质如蓝色葡聚糖－2000或红色葡聚糖，若色带匀称、狭窄、平整→装填胜利血红蛋白的分别①血红蛋白的红色区带匀称、狭窄、平整，随洗脱液缓慢流出→分别胜利②血红蛋白的红色区带歪曲、散乱、变宽→分别效果不好，可能与凝胶色谱柱的装填有关┃┃典例评析__■典例2蛋白质提取和分别分为哪几步(C)A．样品处理、凝胶色谱操作、SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳B．样品处理、凝胶色谱操作、纯化C．样品处理、粗分别、纯化、纯度鉴定D．样品处理、纯化、粗分别、纯度鉴定[解析]蛋白质的提取和分别分为样品处理、粗分别、纯化、纯度鉴定四步。A中凝胶色谱操作及SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳为试验操作过程中的技术。┃┃变式训练__■2．相对分子质量不同的蛋白质在凝胶中的行进过程，可表示为下图中哪一个(B)[解析]本题考查对凝胶色谱法分别蛋白质原理的理解，蛋白质相对分子质量越大，越简洁通过凝胶间隙而先被洗脱，蛋白质相对分子质量越小则易进入凝胶内部而后被洗脱。指引迷津·拨云见日聚丙烯酰胺凝胶电泳和琼脂糖凝胶电泳的区分1．聚丙烯酰胺凝胶电泳(1)凝胶的格子是带有酰胺侧链的碳一碳聚合物，没有或很少带有离子的侧基，因而电泳作用比较小，不易和样品相互作用。(2)由于聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成的物质，在聚合前可调整单体的浓度比，形成不同程度的交联结构，其空隙度可在一个较广的范围内改变，可以依据需分别物质的分子大小，选择合适的凝胶成分，使之既有相宜的空隙度，又有比较好的机械性能。(3)在肯定浓度范围内聚丙烯酰胺对热稳定。凝胶无色透亮，易视察，可用检测仪干脆测定。(4)聚丙烯酰胺是比较纯的化合物，可以精制，削减污染。2.琼脂糖凝胶电泳(1)琼脂糖凝胶电泳操作简洁，电泳速度快，样品不需事先处理。(2)琼脂糖凝胶结构匀称，含水量大，近似自由电泳，样品扩散较自由，电流对样品吸附极微，因此电泳图谱清晰，辨别率高，重复性好。(3)琼脂糖透亮，无紫外汲取，电泳过程和结果可干脆用紫外灯检测及定量测定。(4)电泳后区带易染色，样品极易洗脱，便于定量测定。制成干膜可长期保存。典例3下列关于电泳的说法，正确的是(B)A．电泳是指不带电的分子在电场的作用下发生迁移的过程B．电泳的过程要在肯定的pH下，所以肯定要运用缓冲液C．葡聚糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳是两种常用的电泳方法D．聚丙烯酰胺凝胶电泳中，溶液中加入SDS，电泳的迁移率主要取决于分子所带电荷的多少和分子相对分子质量的大小[解析]电泳的过程实质上是带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程，A项错误；最常用的电泳方法是琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳，C项错误；聚丙烯酰胺凝胶电泳的过程中，为了消退电荷对迁移率的影响，可在凝胶中加入SDS，SDS可以与各种蛋白质形成蛋白质—SDS复合物，SDS所带负电荷的量远远超过蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同种蛋白质之间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小，D项错误；电泳过程要在肯定的pH条件下进行，所以要在溶液中加入缓冲液，以维持溶液pH的稳定，B项正确。核心素养·技能培优案例以下关于猪血红蛋白提纯的描述，不正确的是(D)A．洗涤红细胞时，运用生理盐水可防止红细胞裂开B．猪成熟红细胞中缺少细胞器和细胞核，提纯时杂蛋白较少C．血红蛋白的颜色可用于凝胶色谱法分别过程的监测D．在凝胶色谱法分别过程中，血红蛋白比相对分子质量较小的杂蛋白移动慢[思维过程]A项，思索生理盐水的作用；B项，思索选用猪成熟红细胞的目的；C项，如何监测凝胶色谱法的分别过程；D项，分别过程中，明确相对分子质量的大小与移动速度的关系。