转录组系列讲座05转录因子研究套路课件

转录因子研究套路酸谈学社 套路课

03从课题思路到数据细节全面剖析典型文献01

功能基因研究套路02

lncRNA

研究套路03

转录因子研究套路04

外泌体miRNA研究套路05

ceRNA研究套路06

干湿结合研究套路第

13

节EMSA实验第

14

节ChIP实验第

15

节CRISPR-cas9系统（上）第四章 // 实验技术相关讲解CHAPTER

4

:

THE

RELATIVE

EXPERIMENTS第

16

节CRISPR-cas9系统（下）解

螺

旋 | 陪

伴

医

生

科

研

成

长REFERENCE文献案例IF=7.519第

13

节EMSA实验第

14

节ChIP实验第

15

节CRISPR-cas9系统（上）实验技术相关讲解CHAPTER

4

:

THE

RELATIVE

EXPERIMENTS第

16

节CRISPR-cas9系统（下）EMAS

EXPERIMENTEMAS实验13标记探针蛋白解

螺

旋|陪

伴

医

生

科

研

成

长游离探针Shift实验原理EMAS

EXPERIMENTEMAS实验13阴性对照常规反应super-shift反应探针 突变探针冷竞争反应 冷竞争反应标记探针未标记探针未标记的突变探针蛋白抗体游离探针ShiftSuperShift实验原理解

螺

旋|陪

伴

医

生

科

研

成

长EMAS

EXPERIMENTEMAS实验13EMSA胶配制EMSA结合反应电泳EMSA胶配制：4%非变性聚丙烯酰胺凝胶。EMSA结合反应：设置阴性对照反应、常规反应、探针冷竞争反应、突变探针反应和Super-shift反应。电泳：预电泳10min后进行正式电泳，注意低温电泳。转膜：转NC膜后紫外交联。显色：ECL发光，扫膜或X光片压片、洗片。转膜显色预电泳紫外交联解

螺

旋|陪

伴

医

生

科

研

成

长实验流程EMAS

EXPERIMENTEMAS实验13阴性对照常规反应探针 突变探针冷竞争反应 冷竞争反应super-shift反应游离探针ShiftSuperShift数据分析解

螺

旋|陪

伴

医

生

科

研

成

长EMAS

EXPERIMENTEMAS实验13解

螺

旋|陪

伴

医

生

科

研

成

长得不到阳性结果：注意实验设计。受体发生核转运后到达峰值的时间比较短，多测试几个时间点。如果用药物刺激还需要注意药物渗透和产生细胞因子的过程，时间点可适当延后。核蛋白抽提：使用的核蛋白应保持其天然活性和构像。可以用专门的试剂盒抽提，也可以自己配试剂抽提。注意蛋白的浓度和纯度，浓度应在1ug/ul以上。探针的制备：EMSA探针长度在30-60bp都可以。优先选用文章中的探针序列。优先使用生物素标记的探针，两端都要标记。常见问题第

13

节EMSA实验第

14

节ChIP实验第

15

节CRISPR-cas9系统（上）第四章 // 实验技术相关讲解CHAPTER

4

:

THE

RELATIVE

EXPERIMENTS第

16

节CRISPR-cas9系统（下）ChIP

EXPERIMENTChIP

实验14DNAAgrose

beadsProtein解

螺

旋|陪

伴

医

生

科

研

成

长Antibodycytoplasmnucleus实验原理ChIP

EXPERIMENTChIP

实验14甲醛交联IP解交联核抽提/裂解超声破碎洗涤DNA纯化检测解

螺

旋|陪

伴

医

生

科

研

成

长甲醛交联：1%甲醛室温交联。核抽提和裂解：冰上匀浆，核裂解液室温裂解。超声破碎：Bioruptor高功率超声，具体超声次数依组织及细胞类型而定。IP：超声裂解物中加入Protein

A/G

Plus

beads和抗体及相应的对照IgG进行免疫沉淀。洗涤：先后以不同离子强度的buffer清洗IP后的Protein

A/G

Plus

beads。解交联：将蛋白-DNA复合物从beads上洗脱下后进行解交联。DNA纯化：酚/氯仿法纯化DNA。检测：QPCR或高通量测序。实验流程ChIP

EXPERIMENTChIP

实验14数据分析解

螺

旋|陪

伴

医

生

科

研

成

长ChIP

EXPERIMENTChIP

实验14解

螺

旋|陪

伴

医

生

科

研

成

长每个ChIP反应需要多少蛋白？每个ChIP反应大概需要25μg蛋白投入IP。可以测一下蛋白浓度以确认有足够的蛋白进行IP反应。一定要用ChIP级别的抗体吗？如果没有ChIP级抗体（这种抗体还经常死贵死贵的），可以尝试用多抗去进行ChIP。如果没有合适的多抗，再尝试使用单抗。每个ChIP反应需要多少抗体？每25μg蛋白，使用3-5μg抗体进行IP，最多可以用到10μg。一定要进行甲醛交联吗？转录因子与DNA的结合并不牢固，所以最好要使用甲醛把转录因子与DNA交联到一起。如果是做组蛋白ChIP，由于组蛋白与DNA结合紧密，可以不用交联。常见问题第

13

节EMSA实验第

14

节ChIP实验第

15

节CRISPR-cas9系统（上）第四章 // 实验技术相关讲解CHAPTER

4

:

THE

RELATIVE

EXPERIMENTS第

16

节CRISPR-cas9系统（下）CRISPR-cas9

SYSTEMS

PART

ⅠCRISPR-cas9

系统（上）15Cas9是个核酸酶，结合两个RNA(crRNA,

tracrRNA)就可以切割双链DNA。解

螺

旋|陪

伴

医

生

科

研

成

长Martin

Jinek,et.al.2012.Science.实验原理CRISPR-cas9

SYSTEMS

PART

ⅠCRISPR-cas9

系统（上）15Samuel

H.

Sternberg,et.al.

Nature.2014解

螺

旋|陪

伴

医

生

科

研

成

长实验原理CRISPR-cas9

SYSTEMS

PART

ⅠCRISPR-cas9

系统（上）15PAM crRNAgRNAtracrRNACas9实验原理解

螺

旋|陪

伴

医

生

科

研

成

长CRISPR-cas9

SYSTEMS

PART

ⅠCRISPR-cas9

系统（上）15鉴定混合细胞设计 构建gRNA gRNA载体共转染gRNA载体和Cas9载体单克隆 单克隆筛选 鉴定解

螺

旋|陪

伴

医

生

科

研

成

长设计gRNA：选择位于基因第1或2个外显子的位置，或者关键功能结构域，使用软件设计gRNA。构建gRNA载体：选择合适的gRNA载体，将化学合成的gRNA

oligo退火后装入载体。共转染gRNA载体和Cas9载体：将装有gRNA的重组载体和Cas9过表达载体共转目的细胞。鉴定混合细胞：取部分转染后的细胞，抽提基因组DNA，endo7酶切鉴定。单克隆筛选：使用药物加压结合极限稀释等方法筛选单克隆。单克隆鉴定：挑取单克隆扩大培养，取部分细胞抽提基因组DNA，

endo7酶切鉴定和测序鉴定。实验流程15琼脂糖凝胶电泳或或变性和退火或T7

Endonuclease

IPCR扩增

杂合 CRISPR-cas9

SYSTEMS

PART

ⅠCRISPR-cas9

系统（上） 数据分析杂合 WT杂合WT纯合解

螺

旋|陪

伴

医

生

科

研

成

长

WT CRISPR-cas9

SYSTEMS

PART

ⅠCRISPR-cas9

系统（上）15解

螺

旋|陪

伴

医

生

科

研

成

长选择什么样的载体？在addgene上有非常多的载体选择，还有一些改造过的Cas9蛋白，需要根据不同的实验目的来选择。我在优选365中介绍了各种不同的载体以及CRISPR-Cas9技术的应用供参考。CRISPR-Cas9技术有脱靶风险吗？有。野生型的Cas9蛋白编辑效率比较高，但是脱靶风险也高。使用改造过的Cas9n，以doublenickes系统来进行基因敲除能大大降低脱靶风险。一定要筛选单克隆吗？使用CRISPR-Cas9技术进行基因敲除的效率并不是百分百的，而且经过编辑的细胞其基因的变化情况也各不相同，建议挑选单克隆后再进行后续实验。需要像RNA干扰使用多个靶点以说明特异性一样，使用多个单克隆来进行实验吗？建议选择多个单克隆来进行实验验证。常见问题第

13

节EMSA实验第

14

节ChIP实验第

15

节CRISPR-cas9系统（上）第四章 // 实验技术相关讲解CHAPTER

4

:

THE

RELATIVE

EXPERIMENTS第

16

节CRISPR-cas9系统（下）CRISPR-cas9

SYSTEMS

PART

ⅡCRISPR-cas9

系统（下）16PAM

crRNAtracrRNAgRNA1Cas9PAM

crRNA解

螺

旋|陪

伴

医

生

科

研

成

长tracrRNAgRNA2实验原理CRISPR-cas9

SYSTEMS

PART

ⅡCRISPR-cas9

系统（下）16鉴定混合细胞单克隆筛选构建gRNA载体设计 共转染gRNA载gRNA

体和Cas9载体单克隆鉴定解

螺

旋|陪

伴

医

生

科

研

成

长设计gRNA：选择位于基因第1或2个外显子的位置，或者关键功能结构域，使用软件设计gRNA。构建gRNA载体：选择合适的gRNA载体，将化学合成的gRNA

oligo退火后装入载体。共转染gRNA载体和Cas9载体：将装有gRNA的重组载体和Cas9过表达载体共转目的细胞。鉴定混合细胞：取部分转染后的细胞，抽提基因组DNA，PCR鉴定。单克隆筛选：使用药物加压结合极限稀释等方法筛选单克隆。单克隆鉴定：挑取单克隆扩大培养，取部分细胞抽提基因组DNA，

PCR鉴定和测序鉴定。实验流程CRISPR-cas9

SYSTEMS

PART

ⅡCRISPR-cas9

系统（下）16PCR扩增或琼脂糖凝胶电泳杂合 WT或杂合WT纯合解

螺

旋|陪

伴

医

生

科

研

成

长数据分析CRISPR-cas9

SYSTEMS

PART

ⅡCRISPR-cas9

系统（下）16解

螺

旋|陪

伴

医

生

科

研

成

长这个系统的编辑效率如何？效率会比单切口的系统低。但是脱靶风险小啊。这个系统为什么能降低脱靶风险？因为该