还原型谷胱甘肽（GSH）检测试剂盒实验解决方案

还原型谷胱甘肽（GSH）检测试剂盒实验解决方案原理谷胱甘肽是甘氨酸、谷氨酸和半胱氨酸组成的天然三肽。在红细胞中，还原型谷胱甘肽是维持血红蛋白处于还原状态的关键，保护细胞免受氧化损伤。GSH是细胞中最重要的抗氧化剂巯基化合物，在细胞抗氧化、蛋白质巯基保护和氨基酸跨膜转运中起重要作用。还原型与氧化型比值（GSH/GSSG）是细胞氧化还原状态的主要动态指标。测定细胞内GSH和GSSG含量以及GSH/GSSG比值，能够很好地反映细胞所处的氧化还原状态。CheKine™还原型谷胱甘肽（GSH）检测试剂盒（微量法）提供了一种简单的检测方法，用于检测生物样本，如血清（浆）、动植物组织、血细胞、细胞及细菌中GSH的含量。DTNB与还原型谷胱甘肽反应生成黄色产物。在412nm处有最大光吸收，与样品中还原型谷胱甘肽的浓度成正比。自备耗材·酶标仪或可见光分光光度计（能测412nm处的吸光度）·水浴锅·96孔板或微量玻璃比色皿，可调节式移液枪及枪头·低温离心机·去离子水·匀浆器（如果是组织样本）试剂准备ExtractionBuffer：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。AssayBuffer：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。Chromogen：即用型；4℃避光保存。标准品制备：DilutedExtractionBuffer：ExtractionBuffer用去离子水稀释10倍。取200µLExtractionBuffer加入1,800µL去离子水，DilutedExtractionBuffer用于稀释标准品。10mg/mLGSH标准品：每管用1mL去离子水溶解得10mg/mLGSH标准品，分装后-20℃，避光保存1个月。标准品制备：使用10mg/mLGSH标准品，按照下表所示，进一步稀释标准品：序号Standard(µL)DilutedExtractionBuffer(µL)Concentration(µg/mL)Std.140µLof10mg/mLGSH960400Std.2100µLofStd.1(400µg/mL)100200Std.3100µLofStd.2(200µg/mL)100100Std.4100µLofStd.3(100µg/mL)10050Std.5100µLofStd.4(50µg/mL)10025Std.6100µLofStd.5(25µg/mL)10012.5Std.7100µLofStd.6(12.5µg/mL)1006.25注意：每次实验，请使用新配制的标准品；配制好的标准品需要在4h之内使用。样本制备注意：推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存1个月。处理好的样本须当天检测。测定过程中样本在冰上放置，以免变性和失活。动物组织：称取0.1g组织样本，加入1mL预冷的ExtractionBuffer，快速冰上匀浆。匀浆后的样本，8,000g，4℃离心10min，取上清液，置冰上待测。植物组织：称取0.1g植物组织，加入1mL预冷的ExtractionBuffer，冰浴超声波破碎5min（功率20%或200W，超声3s，间隔7s，重复30次）。超声后的样本，8,000g，4℃离心10min，取上清液，置冰上待测。血清或血浆：将收集的抗凝血于600g，4℃离心10min，30min内吸取上层血浆到另一支试管中，加入等体积的ExtractionBuffer，8,000g，4℃离心10min，取上清液，置冰上待测。血细胞：将收集的抗凝血于600g，4℃离心10min，弃去上层血浆用3倍体积的PBS清洗3次（用PBS重悬血细胞，600g，4℃离心10min），加入等体积ExtractionBuffer，混匀后4℃放置10min，8,000g，4℃离心10min，取上清液，置冰上待测。细胞或细菌：收集2×106个细胞（菌），首先用冷PBS清洗细胞（菌）2次（用PBS重悬，600g，4℃离心10min），加入3倍细胞（菌）沉淀体积的ExtractionBuffer重悬，冰浴超声波破碎5min（功率20%或200W，超声3s，间隔7s，重复30次），8,000g，4℃离心10min，取上清液做进一步分析。注意：该试剂盒提取的样本也适用于氧化型谷胱甘肽（KTB1610）的检测。因ExtractionBuffer中含有蛋白质沉淀剂，因此上清液不能用于蛋白浓度测定。如需测定蛋白含量，需另取相同样本，把ExtractionBuffer换成去离子水提取制备。如需测定蛋白浓度，推荐使用Abbkine货号：KTD3001的蛋白质定量试剂盒（BCA法）进行样本蛋白质浓度测定。实验步骤酶标仪或可见光分光光度计预热30min以上，调节波长至412nm，可见光分光光度计用去离子水调零。在96孔板或微量玻璃比色皿中按照如下方式加样：试剂空白孔（µL）标准孔（µL）测定孔（µL）Sample0020去离子水2000Std.0200AssayBuffer140140140Chromogen404040充分混匀，室温避光孵育2min，记录412nm处吸光度值A空、A标、A测。所有孔测定的吸光度A值减去空白孔的吸光度A空，即ΔA标=A标-A空，ΔA测=A测-A空。注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本的ΔA测高于400µg/mL标准品的ΔA标，将样本用去离子水进一步稀释，乘以最终的稀释倍数，如果ΔA测低于0.01，可增加样本量。结果计算注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。标准曲线的绘制以标准品浓度为y轴，ΔA标为x轴，绘制标准曲线。将ΔA测代入方程得到y值（µg/mL），还原型谷胱甘肽含量(µg/mL)=y。含量计算按样本质量计算GSH含量(µg/g质量)=y×V样÷(V样÷V提取×W)×n=y÷W×n按蛋白浓度计算GSH含量(µg/mgprot)=y×V样÷(V样×Cpr)×n=y÷Cpr×n按细菌或细胞数量计算GSH含量(nmol/104)=y÷(数量÷V提取)×n=y÷500×n=0.002×y×n按液体体积计算GSH含量(nmol/mL)=y×2×nW：样本质量，g；V样：加入样本的体积，2μL；V提取：加入Extraction

Buffer体积，1mL；n：样本的稀释倍数；Cpr：上清液蛋白质浓度，mg/mL；500：细菌或细胞总数，500万个；2：提取液体时稀释一倍。结果展示典型标准曲线：Figure1.96孔板分析的GSH标准曲线。数据和曲线仅供参考，实验者需根据自己的实验建立标准曲线。相关产品CatalogNo.ProductNameKTB