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文档简介
过氧化氢酶(CAT)Pro活性检测试剂盒实验解决方案原理CheKine™Pro过氧化氢酶(CAT)活性检测试剂盒(荧光法)可检测动物或植物组织、细胞、血清(浆)或其他液体等样本,其原理是在检测体系中过氧化氢酶(CAT)分解H2O2产生水和氧气,未分解的过氧化氢在酶和荧光物质存在下反应,其在激发波长535nm和发射波长587nm处的荧光强度与过氧化氢浓度成正比。自备耗材·荧光酶标仪(激发波长为535nm,发射波长为587nm)·全黑96孔板、可调节式移液枪及枪头·低温离心机、恒温箱、制冰机·去离子水,PBS(pH7.0)·匀浆器(如果是组织样本)试剂准备AssayBuffer:即用型;使用前,平衡到室温;4℃保存。ReagentⅠ:即用型;使用前,平衡到室温;用不完的试剂在-20℃避光分装保存,避免反复冻融。ReagentⅡ:即用型;-20℃避光保存。H2O2ReagentⅢ:临用前配制;取5μLReagentⅢ加入4.995mL去离子水,混匀,取15μL稀释后的ReagentⅢ,加入4.395mLAssayBuffer,混匀,现用现配,按需配制,当天内使用。WorkingReagent:临用前避光配制;取50μLReagentⅠ和20μLReagentⅡ,加入4.93mLAssayBuffer,充分混匀,该体积可用100次,按需配制,当天内使用,使用时须避光。Standard(1M):使用前,用去离子水稀释10,000倍得到0.1mM标准品,充分溶解待用。用不完的Standard(1M)-20℃避光分装保存,避免反复冻融。注意:ReagentⅠ有毒,ReagentⅢ有腐蚀性,建议在通风橱进行实验。Standard设置:按下表所示,配制标准品溶液。序号0.1mM标准品体积(µL)去离子水体积(µL)标准品浓度(µM)Std.110010050Std.28012040Std.34016020Std.42018010Std.5101905Std.651952.5Std.72.5197.51.250(空白孔)02000注意:稀释的标准品溶液现配现用,尽快检测,不宜长久放置。样本制备注意:样本以新鲜为宜,若不能立刻检测,应储存在-80℃保存。1.动植物组织:称取0.1g样本,加入1mL冷的AssayBuffer,冰浴匀浆,10,000g,4℃离心10min,取上清液,置冰上待测。2.细胞:收集500万细胞或细菌到离心管内,用冷PBS清洗细胞,离心后弃上清,加入1mL冷的AssayBuffer,冰浴超声波破碎5min(功率20%或200W,超声3s,间隔7s,重复30次),10,000g,4℃离心10min,取上清液,置冰上待测。3.血清或其他液体样本:10,000g,4℃离心10min,取上清液,置冰上待测。注意:1.实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本用AssayBuffer稀释成不同浓度进行预实验,根据预试验的结果,结合本试剂盒的线性范围:0.01-10U/mL,请参考下表稀释(仅供参考)。样本稀释倍数样本稀释倍数10%小鼠脑30-6010%小鼠肺150-300胎牛血清2-10293cells4-10人唾液30-60L929细胞上清不稀释人尿液30-5010%烟草叶2-6如需测定蛋白浓度,推荐使用Abbkine货号:KTD3001的蛋白质定量试剂盒(BCA法)进行样本蛋白质浓度测定。实验步骤1.荧光酶标仪预热到37℃,调节激发波长为535nm,发射波长为587nm。2.操作表(下述操作在全黑96孔板中操作):试剂测定孔(μL)对照孔(μL)标准孔(μL)样本2500Standard0025去离子水0025H2O2ReagentⅢ25250酶标仪上振板10s,37℃反应5minWorkingReagent505050样本0250混匀,室温避光静置10min,荧光酶标仪上设置激发波长535nm,发射波长587nm,测定各孔荧光值,分别记为RFU测定、RFU对照、RFU标准和RFU空白,计算ΔRFU测定=RFU对照-RFU测定,ΔRFU标准=RFU标准-RFU空白。结果计算标准曲线的绘制以标准溶液浓度为x轴,ΔRFU标准为y轴,绘制标准曲线,得到标准方程,将ΔRFU测定带入方程得到x(μM)。CAT活性的计算:按样本蛋白浓度计算:酶活单位定义:37℃条件下,每mg蛋白每分钟分解1nmoLH2O2的量为一个活力单位。CAT(U/mgprot)=x×f÷5÷Cpr按样本鲜重计算:酶活单位定义:37℃条件下,每g组织每分钟分解1nmoLH2O2的量为一个活力单位。CAT(U/g鲜重)=x×f÷5÷W按照细胞数量计算酶活单位定义:37℃条件下,每104个细胞每分钟分解1nmoLH2O2的量为一个活力单位。CAT(U/104cell)=x×f÷5÷N按液体体积计算:酶活单位定义:37℃条件下,每mL液体每分钟分解1nmoLH2O2的量为一个活力单位。CAT(U/mL)=x×f÷5Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;5:反应时间,5min;f:样本稀释倍数;W:样品质量,g;N:细胞总数,万。结果展示ΔRFU标准ΔRFU标准H2O2Standard(μM)Figure1.CAT的标准曲线示例:取0.16g小鼠脑加入1mLAssayBuffer进行匀浆研磨,离心取上清稀释50倍之后按照测定步骤操作,用全黑96孔板测得:RFU测定为10,395,RFU对照为16,600,RFU空白为305,ΔRFU测定=16,600-10,395=6,205,标准曲线为y=568.3x+501.83,H2O2浓度为10.04µM,CAT(样本)=10.04×50÷5÷0.16=627.5U/g鲜重。取胎牛血清离心取上清稀释5倍之后按照测定步骤操作,用全黑96孔板测得:RFU测定为6,380,RFU对照为13,390,RFU空白为305,ΔRFU测定=13,390-6,380=7010,标准曲线为y=568.3x+501.83,H2O2浓度为11.45µM,CAT(样本)=11.45×5÷5=11.45U/mL。相关产品 Ca
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