超氧化物歧化酶（SOD）活性检测试剂盒实验解决方案

超氧化物歧化酶（SOD）活性检测试剂盒实验解决方案原理超氧化物歧化酶（SOD，EC）是催化超氧阴离子歧化成O2和H2O2的酶。它们是抗暴露于O2的所有细胞中超氧化物自由基毒性的重要抗氧化剂。异常的SOD活动与肌萎缩侧索硬化，围产期致死，神经紊乱和癌症等疾病有关。超氧化物歧化酶有三大类：Cu/Zn，Fe/Mn和Ni型。人体中存在三种形式的超氧化物歧化酶。SOD1位于细胞质中，SOD2位于线粒体中，SOD3位于细胞外。CheKine™超氧化物歧化酶（SOD）活性检测试剂盒（微量法），提供一种简单易用的测定法，用于定量测定血清，血浆，组织/细胞和其它生物体液中的SOD酶活性。超氧阴离子（O2-）来源于黄嘌呤氧化酶（XO）催化反应。O2-与四唑盐WST-8反应生成水溶性甲瓒。SOD清除O2-，因此产生更少的显色反应。用比色法测定了SOD在450nm处的抑制活性。SOD的活性与甲臜的生成量成负相关。自备耗材·酶标仪或可见分光光度计（能测450nm处的吸光度）·96孔板或微量玻璃比色皿、可调节式移液枪及枪头·水浴锅，离心机·去离子水·匀浆器（如果是组织样本）试剂准备注意：各组分开盖前，请先低速离心。AssayBuffer：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。SampleDiluent：即用型；使用前，平衡到室温；4℃保存。1×LysisBuffer：使用前，平衡到室温，LysisBuffer(5×)用去离子水稀释至1×LysisBuffer，4℃保存。WST-8：即用型；整个实验过程中，冰上避光放置；分装避光保存于-20℃。Enhancer：即用型；整个实验过程中，冰上避光放置；分装避光保存于-20℃。注意：Enhancer正常为紫红色溶液，如遇发黄，请与Abbkine工作人员联系。Xanthine：即用型；整个实验过程中，冰上避光放置；分装保存于-20℃。如果该组分出现浑浊，使用前请短暂涡旋。WorkingXanthineOxidase：XanthineOxidase分装保存于-20℃；用SampleDiluent将XanthineOxidase1:20的稀释的到WorkingXanthineOxidase，临用前配制，整个实验过程中，冰上避光放置。WorkingReagent：临用前配制；每孔吸取148µLAssayBuffer，10µLXanthine,5µLWST-8,1µLEnhancer，混匀后待用。样本制备动物组织样本：称取0.1g组织加入1mL预冷的1×LysisBuffer将样本进行匀浆。匀浆后的样本，4℃,12,000g离心5min，取上清进行检测。细胞样本：收集5×106个细胞，用预冷的PBS洗细胞，800g离心2min，弃上清。加入1mL预冷的1×LysisBuffer悬浮细胞，冰上孵育10min后，4℃,12,000g离心5min，取上清进行检测。注意：如果需要分别检测胞浆和线粒体的SOD活性，组织/细胞样本的制备，请参考Mattiazzietal(2002).JBC277:29626-33。血清、血浆样本：按常规方法收集血清，SampleDiluent稀释后即可作为血清样本进行检测；用抗凝管收集血液，颠倒混匀。4℃，600g离心10min，移取上清至另一新的离心管中，适量SampleDiluent稀释后即可作为血浆样本进行检测。植物样本：称取0.1g新鲜植物样本，加入1mL预冷的1×LysisBuffer进行超声波破碎。超声波破碎3min（功率30%或300W，超声3s，间隔7s），4℃，12,000g离心5min后，取上清进行检测。注意：推荐使用新鲜样本，如果不立即进行实验，样本可在-80℃保存1个月。处理好的样本须当天检测。测定过程中样本在冰上放置，以免变性和失活。如需测定蛋白浓度，推荐使用Abbkine货号：KTD3001的蛋白质定量试剂盒（BCA法）进行样本蛋白质浓度测定。实验步骤酶标仪或可见分光光度计预热30min以上，调节波长到450nm，可见分光光度计用去离子水调零。测定前将WorkingReagent在37℃（哺乳动物）或25℃（其他物种）孵育5min以上。在96孔板或微量玻璃比色皿中按照如下方式加样：试剂样本孔（µL）样本对照孔（µL）空白孔（µL）空白对照孔（µL）样本202000WorkingXanthineOxidase400400SampleDiluent0402060WorkingReagent164164164164充分混匀，37℃（哺乳动物）或25℃（其他物种）孵育30min后，450nm处测定各孔吸光值A。计算ΔA样本=A样本-A样本对照，ΔA空白=A空白-A空白对照。注意：空白孔和空白对照孔只需各做2-3孔；不同背景颜色的样本需要各设置一个对照孔，去除样本本身的背景色。结果计算注意：我们为您提供的计算公式，包括推导过程计算公式和简洁计算公式。两者完全相等。建议以加粗的简洁计算公式为最终计算公式。抑制百分率的计算抑制百分率=(ΔA空白-ΔA样本)÷ΔA空白×100%注意：尽量使样本的抑制百分率在10-90%范围内。如果计算出来的抑制百分率小于10%或大于90%，则通常需要调整加样量后重新测定。如果测定出来的抑制百分率偏高，则需将样本用SampleDiluent适当稀释；如果测定出来的抑制百分率偏低，则需重新准备浓度比较高的待测样本。SOD酶活性单位：在上述黄嘌呤氧化酶偶联反应体系中抑制百分率为50%时，反应体系中的SOD酶活力定义为一个酶活力单位(U/mL)。SOD酶活性计算：血清（浆）SOD活力计算：SOD活性(U/mL)=[抑制百分率÷(1-抑制百分率)×V反总]÷V样×n=11.2×抑制百分率÷(1-抑制百分率)×n组织和细胞SOD活力计算：按样本蛋白浓度计算SOD活性(U/mgprot)=[抑制百分率÷(1-抑制百分率)×V反总]÷(V样×Cpr)×n=11.2×抑制百分率÷(1-抑制百分率)÷Cpr×n按样本鲜重计算SOD活性(U/g鲜重)=[抑制百分率÷(1-抑制百分率)×V反总]÷(W×V样÷V样总)×n=11.2×抑制百分率÷(1-抑制百分率)÷W×n按细胞数量计算SOD活性(U/104cells)=[抑制百分率÷(1-抑制百分率)×V反总]÷(500×V样÷V样总)×n=0.0224×抑制百分率÷(1-抑制百分率)×nV反总：反应体系总体积，0.224mL；W：样本质量，g；V样：加入反应体系中样本体积，0.02mL；V样总：加入1×LysisBuffer体积，1mL；n：样本稀释倍数；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；500：细胞