《双向凝胶电泳》课件

《双向凝胶电泳》本课程将介绍双向凝胶电泳的基本原理、方法、步骤、应用、优势和缺陷，并提供一些实验技巧和案例分析。让我们深入探索这种强大的蛋白质组学技术。课程目标了解双向凝胶电泳的原理掌握双向凝胶电泳的基本原理，包括等电聚焦和SDS。熟悉双向凝胶电泳的方法学习双向凝胶电泳的具体步骤，包括样品预处理、胶制备、电泳分离和染色分析。掌握双向凝胶电泳的应用了解双向凝胶电泳在蛋白质组学研究中的应用，例如蛋白质表达谱分析、蛋白质差异表达分析等。电泳基本原理电泳电泳是利用带电粒子在电场中的迁移速度不同，实现分离和分析的一种技术。等电聚焦基于蛋白质等电点不同进行分离，等电点是指蛋白质在某一pH值时，其净电荷为零。SDS基于蛋白质分子量不同进行分离，SDS是一种阴离子表面活性剂，可以使蛋白质带上负电荷，并使蛋白质的结构展开。双向凝胶电泳方法1样品预处理2第一向分离（等电聚焦）3第二向分离（SDS）4染色与分析双向凝胶电泳步骤1样品预处理包括蛋白质提取、定量、脱盐和还原等步骤。2第一向分离在等电聚焦胶中进行，将蛋白质按等电点进行分离。3第二向分离在SDS胶中进行，将蛋白质按分子量进行分离。4染色与分析用合适的染色方法对蛋白质进行染色，并用图像分析软件进行分析。样品预处理蛋白质提取从生物样品中提取蛋白质，方法包括裂解、超声波处理、匀浆等。蛋白质定量测定蛋白质浓度，常用方法有BCA法、Bradford法、Lowry法等。蛋白质脱盐去除样品中的盐离子，常用方法有透析、超滤等。蛋白质还原断裂蛋白质中的二硫键，常用还原剂为β-巯基乙醇或二硫苏糖醇。第一向分离1制备等电聚焦胶使用含有非离子型去污剂的等电聚焦胶，如IPG胶。2上样将样品上样到等电聚焦胶的样品槽中。3等电聚焦在电场中进行等电聚焦，蛋白质迁移至其等电点位置。4固定和平衡在等电聚焦结束后，固定蛋白质，并用含有SDS的缓冲液平衡蛋白质。第二向分离制备SDS胶使用含有SDS的聚丙烯酰胺凝胶，常用浓度为10%或12%。上样将等电聚焦后的胶条上样到SDS胶的样品槽中。SDS电泳在电场中进行SDS电泳，蛋白质迁移至其分子量位置。固定和染色在电泳结束后，固定蛋白质，并用合适的染色方法进行染色。染色与分析染色方法常用染色方法包括考马斯亮蓝染色、银染、荧光染色等，选择合适的染色方法取决于实验目的和蛋白质丰度。图像扫描使用凝胶扫描仪扫描染色后的凝胶，获得数字图像。图像分析使用图像分析软件对图像进行分析，识别和量化蛋白质点，并进行差异表达分析。双向凝胶电泳仪器设备双向凝胶电泳仪用于进行等电聚焦和SDS电泳，提供稳定的电源和温度控制。电泳槽用于放置等电聚焦胶和SDS胶，并进行电泳分离。凝胶扫描仪用于扫描染色后的凝胶，获得数字图像。实验试剂及配制1蛋白质提取试剂例如RIPA裂解液、Tris缓冲液等。2蛋白质定量试剂例如BCA试剂盒、Bradford试剂盒等。3等电聚焦试剂例如IPG胶、等电聚焦缓冲液等。4SDS试剂例如聚丙烯酰胺单体、SDS缓冲液、染色液等。第一向胶的制备选择合适的IPG胶根据蛋白质等电点范围选择合适的IPG胶，例如pH3-10、pH4-7等。制备等电聚焦缓冲液按照比例配制等电聚焦缓冲液，通常包含非离子型去污剂、两性电解质等。浇铸IPG胶将等电聚焦缓冲液和IPG胶倒入电泳槽中，并进行凝固。第二向胶的制备1制备分离胶将聚丙烯酰胺单体、SDS缓冲液、TEMED和过硫酸铵按照比例混合，倒入电泳槽中，并进行凝固。2制备浓缩胶将聚丙烯酰胺单体、SDS缓冲液、TEMED和过硫酸铵按照比例混合，倒入电泳槽中，并进行凝固。3准备上样孔在浓缩胶上制作样品上样孔。等电聚焦条件1电压通常从低电压开始，逐渐增加电压，最终达到所需的电压。2电流电流逐渐减小，直至达到稳定状态。3时间等电聚焦时间取决于蛋白质等电点范围、IPG胶的长度和电压等因素。4温度控制温度在合适的范围内，以确保蛋白质的稳定性和胶的完整性。SDS条件电压通常设置为恒定电压，例如100V。电流电流逐渐减小，直至达到稳定状态。时间SDS电泳时间取决于蛋白质分子量范围、胶的长度和电压等因素。温度控制温度在合适的范围内，以确保蛋白质的稳定性和胶的完整性。样品上样等电聚焦上样将样品上样到等电聚焦胶的样品槽中。SDS上样将等电聚焦后的胶条上样到SDS胶的样品槽中。电泳分离等电聚焦在电场中进行等电聚焦，蛋白质迁移至其等电点位置。SDS在电场中进行SDS电泳，蛋白质迁移至其分子量位置。胶片染色考马斯亮蓝染色常用的染色方法，可以使蛋白质呈现蓝色。银染灵敏度较高的染色方法，可以使蛋白质呈现黑色。荧光染色灵敏度高，可以进行定量分析，常用方法包括SYPRORuby染色等。图像扫描与分析1图像扫描使用凝胶扫描仪扫描染色后的凝胶，获得数字图像。2图像分析使用图像分析软件对图像进行分析，识别和量化蛋白质点。3差异表达分析对不同组样品的蛋白质点进行比较，识别差异表达蛋白质。数据分析处理蛋白质点匹配将不同组样品的蛋白质点进行匹配，以确保比较的是同一蛋白质。蛋白质点定量对蛋白质点进行定量分析，获得蛋白质丰度信息。差异表达分析识别差异表达蛋白质，并进行统计分析。双向电泳应用1蛋白质组学研究用于分析蛋白质表达谱，识别差异表达蛋白质，研究蛋白质的功能。2疾病诊断用于检测疾病相关的蛋白质，辅助疾病诊断和治疗。3药物研发用于筛选药物靶点，评估药物疗效。4食品安全检测用于检测食品中的有害物质，例如细菌毒素、农药残留等。双向凝胶电泳优势高通量可以同时分析大量的蛋白质。高分辨率可以分离出等电点和分子量非常接近的蛋白质。灵敏度高可以检测到微量的蛋白质。可重复性好实验结果可重复性较高。双向凝胶电泳缺陷技术复杂操作步骤较多，需要熟练的操作技巧。数据分析复杂需要专业的图像分析软件和数据处理方法。无法分析所有蛋白质只能分析可溶性蛋白质，无法分析膜蛋白等。蛋白质降解问题蛋白质降解会导致实验结果不准确。实验中常见问题胶不均匀可能是胶制备过程中操作不当造成的，例如混合不均匀、温度控制不当等。蛋白质点模糊可能是样品预处理不当、等电聚焦或SDS电泳条件不合适造成的。蛋白质点丢失可能是蛋白质降解、上样量不足或电泳过程中蛋白质迁移过快造成的。实验中的注意事项操作规范严格按照实验操作步骤进行，避免人为误差。仪器设备维护定期维护仪器设备，确保其正常工作。实验记录详细记录实验步骤、参数和结果，以便追溯和分析。典型实验结果展示疑难解答1胶不均匀检查胶制备过程，确保混合均匀、温度控制合适。2蛋白质点模糊优化样品预处理、等电聚焦和SDS电泳条件。3蛋白质点丢失检查样品是否降解、上样量是否足够、电泳条件是否合适。总结回顾双向凝胶电泳原理等电聚焦和SDS，根据蛋白质的等电点和分子量进行分离。双向凝胶电泳步骤样品预处理、胶制备、电泳分离和染色分析。双向凝胶电泳应用蛋白质组学研究、疾病诊断、药物研发、食品安全检测等。双向凝胶电泳优势与缺陷高通量、高分辨率、灵敏度高，但技术复杂、数据分析复杂。参考文献双向凝胶电泳技术及其应用.生物技术通报，2010，26(2):1-5.双向凝胶电泳技术在蛋白质组学研究中的应用.中国科学