《动物微生物与免疫》课件-4. 细菌病的实验室诊断

4.细菌病的实验室诊断网络学习资源：下载中国大学慕课app，搜索动物微生物与免疫，参加学习实验室诊断是在临床诊断的基础上进行的注：疑似感染炭疽杆菌死亡的动物尸体严禁解剖或剥皮，应立即报告上级防疫部门，严格诊断处理。细菌病的实验室诊断方法一、病料的采集二、病料的保存及运送三、细菌病的实验室诊断能否成功分离到病原菌病料的采集和运送是关键一、病料的采集什么是病料？从得病的动物(多为死后)身上采集的组织或器官，用来进行疾病的研究工作。因此采集病料就要和得病的动物直接接触一、病料的采集人畜共患病：新冠肺炎、布氏杆菌病、禽流感、狂犬病、沙门氏菌病等很多病原微生物能在环境中长时间存在思考：为了自身健康和环境安全，我们在临床上采集病料时应该注意什么问题？东北农业大学28名师生感染布氏杆菌病通过观看视频，28名师生感染布氏杆菌事件对我们有什么启示？进行人畜共患传染病病尸的剖检时：皮肤：戴手套，穿工作服（防护服）眼睛：有黏膜，因此要带防护眼罩呼吸道、消化道：要带口罩，口罩一定要罩住鼻子。防止自身感染：做好个人防护剖检场所：剖检前后都应消毒剖检后的器械、设备进行严格消毒动物尸体处理：焚烧、高压蒸汽灭菌或深埋防止病原散播：做好环境消毒一、病料的采集病料采集需要遵循哪些原则？无菌采样适时采样适当部位适量采样目的：防止病料被污染方法：—

所有器械和容器必须严格灭菌—

注意无菌操作病料采集的原则—无菌采样细菌丰富增殖时期：取濒死动物或刚死亡的动物。最好在使用抗生素前采集。病料应该新鲜：死亡动物采集病料夏天不宜迟于6~8h,冬天不迟于24h，否则病料组织可能发生变性、腐败。病料采集的原则—适时采样目的：取含致病菌最多的组织或器官充分了解各种病原菌在患病动物体内的分布情况，有目的地进行采样根据疾病的类型和表现采集病变最典型的部位病料采集的原则—适当部位生前有神经症状的疾病：脑、脊髓和脑脊液局部性疾病：病变部位的组织如坏死组织、脓肿病灶等败血症：血液、肝脏、肾等动物群体：一个动物的样本量是不够的，例如对患病鸡群进行样品采集时会采集10只以上。患病动物：单个样本量要足够，以便在复检时还有足够的样本。病料采集的原则—适量采样如何对病料进行采集呢？一、病料的采集实质脏器液体材料胃肠道及其内容物病料采集的方法：实质脏器一、病料的采集注：一个容器只装一个动物的病料，不应把数个动物的病料混合装在一起。病料采集的方法：液体材料一、病料的采集体腔液可用注射器吸取；脓汁一般用灭菌的棉棒收集，放入灭菌试管内，塞好棉塞送检。血液：可无菌操作从静脉或心脏采血，然后加抗凝剂（柠檬酸钠）。血清：则采血后放在灭菌的容器中，摆成斜面，待血液凝固析出血清后，再将血清吸出，置于另一灭菌试管中送检。病料采集的方法：胃肠道及其内容物一、病料的采集肠道：只需选择病变最明显的部分，将其中内容物去掉，用灭菌生理盐水轻轻冲洗后放在平皿内。粪便：应采取新鲜的带有脓、血、黏液的部分。剪一段两端扎好的肠管，直接送检。二、病料的保存及运送冷藏箱液氮罐（-196℃）临床标本预处理增菌接种培养基，分离单个菌落各种鉴定试验涂片染色快速诊断试验生化试验血清学实验动物试验初步诊断，决定是否进行细菌培养最终诊断报告分子生物学技术涂片染色三、细菌病的实验室诊断1）细菌的形态检查：涂片染色三、细菌病的实验室诊断镜检看什么？细菌的有无、数量、形态、分布、结构（有无荚膜、芽孢、鞭毛）等，进行初步鉴定1）细菌的形态检查：涂片染色三、细菌病的实验室诊断链球菌葡萄球菌1）细菌的形态检查：涂片染色三、细菌病的实验室诊断巴氏杆菌（两级染色）炭疽芽孢杆菌（如竹节状）1）细菌的形态检查：涂片染色三、细菌病的实验室诊断产气荚膜梭菌（荚膜染色法）破伤风梭菌1）细菌的形态检查：涂片染色三、细菌病的实验室诊断大肠杆菌沙门氏菌1）接种环是细菌学实验必需的工具。2）超净工作台、无菌室三、细菌病的实验室诊断2）细菌的接种和分离培养接种工具三、细菌病的实验室诊断2）细菌的接种和分离培养增菌：方式：增菌培养基（液体培养基：选择性、非选择性）病料中病原菌少，或有抗生素残留时，用固体培养基无法分离出菌落已污染的被检材料：如饮水、粪便、已腐败组织等，因含杂菌数远超过病原菌，需要增菌培养后再进行分离。平板划线分离：三、细菌病的实验室诊断2）细菌的分离培养涂布平板法、倾注平板法：三、细菌病的实验室诊断2）细菌的分离培养三、细菌病的实验室诊断2）细菌的分离培养通常选用适合目标菌生长的平板培养基对细菌进行分离培养。

也可采用选择培养基或鉴别培养基，以起到抑制杂菌或快速鉴别的效果。比如肠道杆菌科可选择麦康凯琼脂、伊红美蓝琼脂。—

不同细菌的菌落大小、形态、色泽、表面特征、边缘状态、隆起度、透明度等特征不同。有的细菌在鲜血琼脂平板上形成溶血环。三、细菌病的实验室诊断2）细菌的分离培养大肠杆菌在伊红美蓝培养基上形成黑色带金属光泽的菌落大肠埃希氏菌：边缘整齐、稍凸起、表面光滑、湿润的桃红色菌落，周围有浑浊胆盐沉淀圈鼠伤寒沙门氏菌：无色或灰白色菌落，透明或半透明麦康凯琼脂培养基三、细菌病的实验室诊断3）细菌的鉴定进行生化试验的细菌必须是纯培养物。通过检测细菌的代谢产物进行细菌鉴定。例如，肠道菌种类繁多、形态、染色性和菌落等较为相似，但肠道菌生化反应活泼，可根据其分解糖和蛋白质的差异进行区别。检验时，根据可疑细菌的生化特性选择特定的一组生化试验，将结果与标准进行对比，以确定病原菌的种类。细菌的生化试验：IMViC试验IMViC试验：吲哚实验（Indoltest）、甲基红（MR）实验、乙二酰（VP）实验、柠檬酸盐利用试验（Citratetest)的合称缩写，常用来鉴定肠道杆菌。试验大肠杆菌吲哚+甲基红+VP-柠檬酸盐利用试验-吲哚实验甲基红实验VP实验柠檬酸盐利用试验IMViC试验：吲哚实验吲哚实验结果IMViC试验：甲基红（MR）实验①试验菌用葡萄糖蛋白胨培养基37°C培养24小时。②沿管壁加入甲基红试剂3-4滴，红的为阳性，黄的为阴性。甲基红实验结果葡萄糖丙酮酸甲酸、乙酸、乳酸等IMViC试验：乙二酰（VP）实验VP实验结果+碱→二乙酰红色化合物+蛋白胨中精氨酸所含胍基IMViC试验：柠檬（枸橼）酸盐利用试验VP实验结果某些细菌能利用培养基中的柠檬酸钠为唯一碳源而获得能量，能利用柠檬酸盐的细菌，也能利用铵盐作为唯一氮源，分解后生成碳酸钠和氨，使培养基变为碱性。此时培养基中的溴麝香草酚蓝指示剂由绿色变为深蓝色。三、细菌病的实验室诊断3）细菌的鉴定体外进行的抗原抗体反应：用已知抗体检测动物体内的病原菌用已知的病原菌抗原检测动物血清中的抗体血清学试验：检测对象：细菌抗原或细菌的特异性抗体试验类型：凝集实验、沉淀试验等布氏杆菌的检疫已知未知阳性：块状凝集三、细菌病的实验室诊断3）细菌的鉴定观察细菌的致病性：动物精神状态、体温、体重和血液变化等；病变和死亡情况测定细菌的毒力：半数致死量（LD50）细菌的纯培养动物接种试验：将待检菌液接种到动物体内，观察动物的发病情况，进一步确认可疑细菌的致病作用，从而进一步鉴定细菌。三、细菌病的实验室诊断3）细菌的鉴定动物接种试验：常用的动物接种途径：接种对象：本动物OR试验动物三、细菌病的实验室诊断3）细菌的鉴定分子生物学技术：基因水平鉴定细菌—PCR诊断技术—核酸杂交技术优点（与传统鉴定方法相比）：灵敏度高：理论上可以检测出一个细菌简便快速：2~4h获得结果对检测样品的要求低：不需要活的病原体三、细菌病的实验室诊断3）细菌的鉴定分子生物学技术：分子生物学技术出现后，传统的细菌鉴定方法是不是就没有意义了？三、细菌病的实验室诊断3）细菌的鉴定分子生物学技术：缺点：无法区分或细胞和死细胞因灵敏度很高，环境中存在的抑制剂以及在样品保存、浓缩和提纯过程中所带来的污染会抑制PCR反应，或是造成假阳性后果，从而影响实验结果的准确性。三、细菌病的实验室诊断3）细菌的鉴定分子生物学技术：分子生物学尚不能完全取代传统微生物技术，还