骨髓造血干细胞

造血干细胞移植

进展云南省肿瘤医院血液科何明生博士11999年12月美国《SCIENCE》

人类干细胞研究

列入人类十大科学成就

榜首22003年度

十大科学进展中同样涉及了干细胞，即鼠的胚胎干细胞在培养皿中既能发育成精子也能发育成卵子，有望发展出新一代的试管婴儿技术。

3hematopoieticstemcellinPubMedItems1-500of5666312/5/20054干细胞移植进展

第一部分基础理论第二部分实验技术第三部分临床移植51．骨髓造血干细胞的基本概念骨髓造血干细胞(hematopoieticstemcell,HSC)是指存在于骨髓中的一小群具有无限或较长期的自我更新能力,并具有多向分化潜能的原始造血细胞61．骨髓造血干细胞的基本概念传统观念认为HSC的生物学特征是：①具有高度增殖分裂能力；②能多向分化产生各系血细胞；③可移植性；④能自我更新(self-renew)，持久地维持正常造血功能。72.骨髓造血干细胞的研究历史

82.骨髓造血干细胞的研究历史9造血干细胞移植

在近30年里迅猛发展壮大至今

1990年，美国的Thomas因在骨髓移植中做出重要贡献，从而共同获得该年度的诺贝尔生理奖和医学奖，这是临床医学首次获得此项殊荣。103.造血干细胞的体外研究造血干细胞向红细胞分化造血干细胞向粒细胞分化造血干细胞向单核细胞分化造血干细胞向淋巴细胞分化造血干细胞向血小板分化造血干细胞向NK细胞分化113.造血干细胞的体外研究造血干细胞还可向心肌细胞分化、肝细胞、神经组织细胞、血管内皮细胞等非血液细胞分化124．造血干细胞的体内特性骨髓造血干细胞来源于胚胎干细胞的成血－血管内皮细胞，经由卵黄囊、胎肝、胸腺、脾、最后到骨髓，在体内不断增殖发育，产生髓系、红细胞系和淋巴细胞系，逐步分化至各系成熟血细胞。4．造血干细胞的体内特性134．造血干细胞的体内特性骨髓造血干细胞在体内具有高度的自我更新能力和多向分化潜能，不断的产生髓系、红系和淋巴系细胞。4．造血干细胞的体内特性14神经性疾病

南佛罗里达医学院和佐治亚医学院的研究人员在2003年美国神经年会上报告，将血液中的干细胞移植到卒中大鼠的大脑中能大大促进大脑的功能恢复。15神经性疾病巴西圣保罗大学的研究小组从30例脊椎损伤所致瘫痪患者的血液中抽取干细胞，再注入患者脊椎动脉血管，几个月后，12例患者的瘫痪肢体恢复了知觉。16神经性疾病

我们与昆医神经科学研究所的合作研究表明，骨髓的CD34+细胞移植对恢复全脊髓损伤有治疗作用，相关论文正在审稿之中。17（HSC）向神经细胞（NC）分化及其治疗脊髓损伤的研究

干细胞移植成为治疗神经系统退行性疾病唯一可能有效的手段。但是，目前NSC移植还未广泛用于临床实践中，原因主要有3点：NSC取材困难，需做开颅手术，对患者创伤较大，给患者带来较大痛苦。再加上神经系统退行性疾病患者多为高龄者，故患者已经受不住神经干细胞移植。18（HSC）向神经细胞（NC）分化及其治疗脊髓损伤的研究

NSC分离提纯技术尚未成熟，想要得到一定数量一定纯度的NSC困难较大。NSC较脆弱，易受各种因素的影响，即使分离提纯出NSC，也很难断定这些神经干细胞仍具有正常功能和特性，以及将这些“神经干细胞”注入神经系统后能否分化为一定数量的神经细胞。19（HSC）向神经细胞（NC）分化及其治疗脊髓损伤的研究

与NSC相比HSC具有以下优点：1）HSC取材容易，无论是骨髓HSC还是外周血HSC的采集都具有创口小、患者痛苦小、安全性高的特点。2）HSC的分离提纯技术已较为成熟，可较容易的得到一定数量一定纯度的HSC。20（HSC）向神经细胞（NC）分化及其治疗脊髓损伤的研究

3）对干细胞的认识首先从HSC开始，因此关于HSC的研究较NSC要深入得多。4）HSC呈悬浮状态，再采集和培养等过程中损伤较小。21（HSC）向神经细胞（NC）分化及其治疗脊髓损伤的研究

临床价值可将HSC培养分化出“神经细胞”的特性及功能，将这些“神经细胞”注入神经系统病变局部，从而替代或部分替代受损神经细胞的功能治疗神经系统疾病。HSC源自患者本人，既可以避免移植后免疫排斥反应，年龄的限制也可延长。22（HSC）向神经细胞（NC）分化及其治疗脊髓损伤的研究

预期研究成果1、骨髓干细胞可诱导分化为具有神经细胞功能的细胞2、骨髓干细胞诱导分化的神经细胞对脊髓损伤有治疗作用23第二部分

实验技术241.问题①如何取得干细胞②如何体外培养干细胞③如何保持体外培养干细胞的生物学特性252.髓造血干细胞的培养原理骨髓造血干细胞的体外培养指在模拟体内生理环境等特定的体外条件下，进行干细胞的孵育培养，使之生存并生长。造血干细胞体外培养呈悬浮状生长，无需底物支持。1.体外培养原理263.动物取材在置备细胞悬液之前须将目的细胞所在组织材料分散成单细胞。机械分离和酶学解离是将组织分散成单细胞最常用的方法。273.1细胞悬液的制备

介绍两种方法：①在无菌条件下利用穿刺法从髂骨抽取骨髓，缓慢加入到比重为1.077g/㎝3的淋巴细胞分离液中，经密度梯度离心吸取白细胞层，多次离心后可得到骨髓单个核细胞（BMNC），重新悬浮在含有10U/ml肝素的RPMI-1640液中，制成细胞悬液。283.1细胞悬液的制备

介绍两种方法：②无菌条件下从髂骨抽取骨髓经输血滤网过滤后，自然沉淀，去除大部分红细胞，再以200r/min低速离心，漂洗2～3次去除血浆，保留有核细胞。

然后加入到RPMI-1640液中，制成密度为（1～5）×107MNC/ml的细胞悬液。293.2培养方法两种常用的干细胞分离方法:1、免疫亲和柱分离法2、免疫磁珠分离法301）免疫亲和柱分离法具体方法如下：取收集的单核细胞置于RPMI1640培养液中，并加入胎牛血清过夜，以除去贴壁的细胞，在形成玫瑰花环的细胞中直接加入生物素标记的抗-CD34单克隆抗体，于4℃条件下旋转孵育30分钟，然后用Hanks液清洗。311）免疫亲和柱分离法将结合好的细胞放入亲和层析柱中，通过亲和素和生物素的结合作用，标记的细胞被亲和柱吸收，清洗亲和柱除去非特异结合的细胞，即可获得CD34＋细胞。322）免疫磁珠分离法此法特异性高、纯度好、简便快速、可以处理大量的细胞样品以满足临床移植的需要。33c磁珠准备从被覆绵羊抗小鼠IgG1（Fc）抗体DynabeadsM-450的小瓶中（磁珠密度4×108/ml，30mg/ml），按0.5个磁珠/MNC的比例取出预计磁珠量，用RPMI/HAS漂洗后将磁铁置于试管外壁吸引2分钟，弃去上清液，收集磁珠，加入RPMI/HAS/IG1ml悬浮磁珠，置于冰浴中，立即使用。34d致敏细胞用CD34单克隆抗体（9C5）按0.5µg/106细胞比例致敏细胞，MNC浓度为（1～5）×107MNC/ml，混合均匀后置于4℃的旋转混合器上以4r/min的速度低速转动孵育30～60分钟，用RPMI/HAS清洗细胞后4℃低速离心5分钟，去除未结合的单克隆抗体，最后将致敏细胞加入RPMI/HAS中形成细胞悬液。35e混合按磁珠与致敏细胞0.5:1的比例将致敏细胞与磁珠结合，在4℃旋转混合物器上转动混合30分钟，用磁铁在管壁外吸引，收集磁珠-玫瑰花环形成细胞，再用RPMI/HAS漂洗，除去非玫瑰花环形成细胞。363）培养造血干细胞的常用方法①液体悬浮培养法②体外集落形成实验

③骨髓基质细胞培养法

④微载体-微囊培养技术374.鉴定结果

一般采用脾结节形成测定法，计数脾脏的结节数一个造血干细胞增殖分化成一个集落，通常植入的造血干细胞数与生成的脾结节数呈线性相关。384.鉴定结果

采用造血干细胞表面标志即分化抗原的鉴定造血干细胞。如CD34分子、血管内皮生长因子受体2（VEGFR-2,又称KDR）CD133（AC133）分子。39体外细胞的生长过程体外细胞培养的过程大致分为原代培养期、传代期和衰退期三个阶段。

原代培养期：细胞自体内新鲜组织取出并在体外培养生长至第一次传代的时期，约持续1～4周。此期细胞活动较活跃40体外细胞的生长过程传代期：原代培养的细胞生长至一定时间后，达到较高密度，此时应将原代细胞接种至其他培养皿中，此过程称为传代。衰退期：此期细胞仍在生存，但增殖很慢或不增殖。细胞形态轮廓增强，直至衰退死亡。41培养细胞的传代生长过程细胞传一代经历四个阶段：滞后期对数生长期稳定期衰退期42滞后期

包括悬浮期和潜伏期。细胞的胞质收缩，包体呈圆球状，悬浮于培养基中。经过一段时间的培养，有活力的细胞开始附着于底物并逐渐延伸，恢复原来的形态，但还不分裂增殖。正常细胞的滞后期约为24～96小时。43对数生长期细胞增殖旺盛，开始阶段细胞的增长速率与最初细胞数成正比，此时细胞数量呈指数增长。此期持续时间的长短因细胞本身的特性和培养条件而异，一般持续3～5天。44稳定期此期细胞虽仍保持分裂增殖能力，但增殖的细胞数与死亡的细胞数相当，从而处于一种动态平衡的状态。45衰退期处于稳定期的细胞如不传代或不加入新的培养基，则会进入衰退期，逐渐死亡。此期死亡细胞数超过分裂细胞数，细胞数因此逐渐减少。46培养细胞的细胞周期

G1期发生在上一细胞周期的M期之后，此细胞周期S期之前，有称为细胞分裂后期。在G1期主要发生与DNA合成前有关的生化变化。S期此期主要进行DNA的合成，各种细胞的S期持续时间的差别较小，一般为6～8小时。47培养细胞的细胞周期

G2期发生在DNA合成后或细胞分裂前，有称细胞分裂前期。G2期持续时间较短，一般为2～3小时。M期即细胞分裂期。处于分裂期的细胞是评价细胞增殖和生长能力的参考指标。此期持续时间很短，一般只有1～2小时485.注意事项污染预防和处理培养基成分培养基的酸碱度495.注意事项另外①接种细胞应处于对数生长状态。处于静止期的细胞在新鲜培养基中开始阶段生长缓慢或根本不生长。505.注意事项②细胞接种前，培养基要预先加热至37℃，培养基的PH用CO2预先平衡。③细胞的接种密度要大于1×105/ml。51

5.注意事项④搅拌速度在100～300r/min的范围内，能够保持细胞处于均匀的悬浮状态即可。⑤至少每天取样一次，检测细胞的生长状况和计数细胞密度。52

第三部分

临床移植531.1移植的基本概念对患者进行超大剂量化疗和（或）放疗以摧毁患者的造血和免疫功能，同时最大限度的杀灭肿瘤细胞，然后输入正常供体的造血干细胞或预先采集的患者自体造血干细胞，以重建患者的造血和免疫功能，称为造血干细胞移植技术。541.1移植的基本概念造血干细胞主要存在于单个核细胞中，表达CD34抗原。CD34+细胞占单个核细胞的1%～4%。大量研究提示，CD34+HSC源于CD34-HSC，即CD34-细胞才是真正的造血干细胞。551.2骨髓移植的分类

自体骨髓造血干细胞移植（AHSCT）.同基因造血干细胞移植,即单卵孪生同胞（identicaltwin）供髓。561.2骨髓移植的分类

异基因造血干细胞移植（Allo-HSCT），包括：HLA相合或半相合的同胞供髓；HLA相合或部分相合的相关供髓；HLA相合或部分相合的无关供髓。571.3骨髓移植前的准备最重要的是移植患者的准备58①系统检查及注意事项a．原发病状况b．心，肺，肝，肾功能c．糖代谢功能d．口腔科检查此外，应去处隐性感染灶，如耳、鼻、喉、肛周等处的病灶。59②全环境保护全环境保护（tTEP）包括口服肠道不吸收抗生素（常用抗生素有黄连素、庆、无菌饮食、皮肤清洁消毒和眼、耳、鼻、口腔、脐、阴道等部位的消毒；住空气层流病房（LAFR）等。60②全环境保护TEP的时间应持续10～14天左右，其目的是尽量减少患者体内致病菌的负荷，从而最大限度地降低骨髓移植后感染的发生率。61③移植前预防感染的措施清除感染灶及体内已存在的病原体，以防预处理激活体内已存在的病原体。a．细菌感染的预防b．真菌感染的预防c．病毒感染的预防621.4供者的选择骨髓移植供髓者的选择关系到骨髓移植的方法、预处理方案、移植后处理及预后等。631.4供者的选择供受者之间HLA相合与否直接影响着造血干细胞移植的成败，所以通过HLA的检测来筛选供者。641.4供者的选择HLA基因系统是人类主要组织相容性复合体。由一系列紧密连锁的基因坐位所组成的HLA系统构成了人体生物学的“身份证”。651.4供者的选择个体的免疫活性细胞均以HLA作为识别“自己”与“非己”的标志，从而通过免疫反应排除“非己”，保持“自体”的完整性。661.5移植免疫学现代医学三大支柱：1、神经生物学：解决生物信息如何传递问题2、分子免疫学：认识自己和排斥异己的问题3、分子生物学：研究分子机制的方法和工具671.6骨髓造血干细胞的采集麻醉抗凝采髓前准备骨髓采集采髓部位为髂后上棘，多点穿刺，分次采取。采集的有核细胞数应＞2×108/kg，CD34+细胞应＞2×106/kg。1.5骨髓造血干细胞的采集681.7预处理移植前的预处理是指移植前14天到移植时给予患者的化学药物治疗及放射治疗。691)目的①最大限度的消灭患者体内的异常克隆或肿瘤细胞，减少复发；②破坏患者免疫系统，为造血干细胞的植入提供条件，防止排斥反应；③清除异常细胞，为造血干细胞及基质细胞的植入和增殖提供必要的空间。1)目的701)目的①最大限度的消灭患者体内的异常克隆或肿瘤细胞，减少复发；②破坏患者免疫系统，为造血干细胞的植入提供条件，防止排斥反应；③清除异常细胞，为造血干细胞及基质细胞的植入和增殖提供必要的空间。1)目的71①用于消除白血病细胞或肿瘤细胞的措施全身照射（TBI）+化疗不含TBI的联合化疗72②抗肿瘤化学药物

几乎所有的抗白血病药物均可用于白血病患者骨髓移植的预处理73③用于抑制受者免疫功能的药物a．抗淋巴细胞球蛋白（ALG或ATG）b．全淋巴结照射（TLI）c．最常用药物有环孢菌素(CSA)741.8移植并发症1)造血和免疫功能受抑2)出血性膀胱炎3)间质性肺炎751.8移植并发症

4)肝静脉闭塞病5)移植物抗宿主病（GVHD）和移植排斥反应6)晚期并发症762．骨髓造血干细胞移植的临床应用血液病1、血液肿瘤白血病2、非血液肿瘤再生障碍性贫血2．骨髓造血干细胞移植的临床应用772．骨髓造血干细胞移植的临床应用非血液病1、实体瘤1）乳腺癌2）小细胞肺癌3）生殖腺肿瘤2．骨髓造血干细胞移植的临床应用78HSCandlungcancer

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HSCandbreastcancer

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12/5/2005

（fromPubMed）

792．骨髓造血干细胞移植的临床应用4）神经母细胞瘤5）其他进行造血干细胞移植的实体肿瘤还有脑胶质瘤、结肠癌、胃癌、胰腺癌、肾细胞癌、黑色素瘤、肉瘤、鼻咽癌等，有效率0～100%不等。2、自身免疫性疾病2．骨髓造血干细胞移植的临床应用803.移植适应症的扩大与缩小1998年美国学者Goldman等干细胞移植的适应症分成4类：①