《仪器分析》第八章++液相色谱分析课件

液相色谱法了解液相色谱法的优点及适用范围理解常用检测器原理、优缺点及适用范围理解各种分离方式的原理、适用的分析对象及选择原则理解超临界流体色谱法的原理、优缺点及适用范围《仪器分析》第八章++液相色谱分析HPLC与GC的区别：GC流动相惰性，HPLC流动相与组分有作用HPLC一般在室温下进行、GC多在高温下进行应用范围－全部色谱分离对象的20％GC，HPLC约占80％HPLC更适合于制备1）液体的扩散系数比气体的小倍左右；2）液体粘度比气体约大100倍；3）液体表面张力比气体大104倍；4）液体密度约大1000倍；5）液体比气体不可压缩。《仪器分析》第八章++液相色谱分析1固定相和流动相（1）固定相按照承受压力来分：

刚性固体－硅胶，耐高压，表面可键合各种功能团

硬胶－聚苯乙烯与二乙烯基苯交联而成，承压能力低，主要用于离子交换和尺寸排阻色谱《仪器分析》第八章++液相色谱分析按照孔隙深度来分：

表面多孔型－实心玻璃外面覆盖一层多孔活性物质，如硅胶、氧化铝、离子交换剂和聚酰胺等，厚度1－2

m，以形成无数向外开放的浅孔。

全多孔微粒型－由直径为10-3数量级的硅胶微粒凝聚而成，颗粒细，孔浅，相对死体积小，出峰快，柱效高，但需要更高的操作压力。最大允许进样量比表面多孔型大5倍《仪器分析》第八章++液相色谱分析（2）流动相纯度高粘度低化学稳定性好沸点高于55ºC

溶剂要完全浸润固定相与检测器匹配《仪器分析》第八章++液相色谱分析2高效液相色谱仪1）储液器；2）脱气器；3）高压泵；4）进样器；5）色谱柱；6）检测器。《仪器分析》第八章++液相色谱分析

主要部件：储液器－耐腐蚀、配2m镍合金过滤器脱气装置－氦气鼓泡来驱除溶在溶剂中的气体高压泵输送流动相，压力几Mpa至数十MPa。无脉动或者脉动很小流量稳定可调、耐腐蚀、密封性好恒压泵：压力恒定，泵腔体积大，流量随外界阻力改变而改变，逐渐被恒流泵取代

气动放大泵恒流泵：流量恒定

往复活塞泵、螺旋传动注射泵《仪器分析》第八章++液相色谱分析梯度洗脱装置类似于气相色谱中的程序升温两种、三种或者四种溶剂按照比例进行混合，进行二元、三元、四元梯度淋洗优点：改善峰形、提高柱效、分析时间减少；缺点：更换流动相达到平衡的时间需要更长常采用低压梯度:

一台高压泵,通过比例调节阀,将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。或者：利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。《仪器分析》第八章++液相色谱分析进样器高压进样阀－用微量注射器将样品注入样品环管（10L到2mL）《仪器分析》第八章++液相色谱分析色谱柱色谱系统的心脏优质不锈钢管，内壁光洁平滑接头死体积尽可能小为了保护色谱柱不被污染，有时候需要在分析柱前加一根短柱，称为卫柱。为了防止由于卫柱而过分增加压力，在卫柱中使用的颗粒大小约10－30m。柱体为直型不锈钢管，内径1～6mm，柱长5～40cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。《仪器分析》第八章++液相色谱分析检测器紫外检测器

70％应用，氘灯，适用于梯度淋洗对流动相速度变化不敏感溶剂选择时紫外检测器波长不能小于溶剂的紫外截至波长；《仪器分析》第八章++液相色谱分析

紫外检测器的重要进展：光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。《仪器分析》第八章++液相色谱分析荧光检测器－灵敏度比紫外高2个数量级

高灵敏度、高选择性；对多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应；《仪器分析》第八章++液相色谱分析示差折光检测器通用型，灵敏度低，温度影响大，不能用于梯度淋洗；偏转式、反射式和干涉型三种；《仪器分析》第八章++液相色谱分析电化学检测器电导检测器、库仑检测器、伏安检测器以及安培检测器。电导检测器只用于离子色谱。安培型最常用，灵敏度高，选择性好。《仪器分析》第八章++液相色谱分析紫外吸收示差折光荧光安培类型选择性通用性选择性选择性线性范围2.4

104104～103104最小检测量ng0.1~1102

～10310-3

～10-20.01~1梯度淋洗能不能能不能流速敏感性不敏感不敏感不敏感敏感温度敏感性低敏感低敏感HPLC检测器性能比较《仪器分析》第八章++液相色谱分析3液-固色谱法（1）原理吸附能力大小

与吸附剂比表面积、物理化学性质、组分分子结构、流动相性质有关。组分、溶剂竞争吸附活性中心分离非离子型、不溶于水的几何异构体

非极性石油烃的组成分析、芳香异构体等《仪器分析》第八章++液相色谱分析（2）固定相常用的是表面多孔和全多孔微粒型硅胶、氧化铝等。一般采用5-10m全多孔微粒。《仪器分析》第八章++液相色谱分析（3）流动相极性大的组分选择极性强的流动相，极性小的选择极性弱的流动相。对于给定的吸附剂，溶剂强度用溶剂强度参数

表示，即单位面积吸附剂表面的溶剂吸附能。

越大，溶剂极性越大。保留值主要取决于官能团类型和数目。各类物质的保留值顺序：饱和烃<烯烃<芳烃有机卤化物<硫化物<醚<硝基化合物<腈<酯醛酮<醇胺<酰胺<羧酸<磺酸《仪器分析》第八章++液相色谱分析4化学键合相色谱法（1）化学键合相

硅胶表面的硅羟基，能与合适的化合物反应。1）消除或者掩盖了表面吸附活性点，使表面性质均匀，缓和不可逆吸附，提高峰对称性。2）耐溶剂冲洗，没有固定液流失。3）改变键合的有机分子的结构和官能团类型，能改变固定相的分离选择性。4）固定液稳定性高，配用高灵敏度检测器，可以降低最低检出量。《仪器分析》第八章++液相色谱分析键合反应类型：1.Si-O-C键型（硅胶和醇类的反应）

发展初期使用的，在有水、醇存在下，有水解和醇解的可能，只能在正相条件下使用。

2.Si-N-C、Si-C键型（卤化硅胶和胺类的反应）热和化学稳定性比酯型好。从理论上讲，这种结构具有更好的稳定性，特别是对于微碱性流动相，而且R基可以多次氯化，形成聚烷基键合相，但是制备困难。《仪器分析》第八章++液相色谱分析3.Si-O-Si-C键型（硅胶和有机硅烷的反应）目前用得最多的类型。具有良好的热合化学稳定性，能够在pH2~8.5的介质中使用。《仪器分析》第八章++液相色谱分析（2）正相键合相色谱流动相极性小于固定相，常常是混合溶剂，由非极性溶剂与极性溶剂混合而成，极性增大，保留值降低。适合于分离中等极性的化合物，如脂溶性维生素、甾族、芳香醇、芳香胺、脂、有机氯农药等。《仪器分析》第八章++液相色谱分析影响反相键合相色谱保留值的因素：碳链长度。碳的负载量和表面覆盖率。载体孔径尺寸与纯度残余硅醇基数目（3）反相键合相色谱

C18和C8最常用，流动相为极性溶剂。极性大的组分先流出，极性小的后流出。《仪器分析》第八章++液相色谱分析反相色谱流动相

水和与水混溶的有机溶剂混合组成。溶剂强度可以调节，极性越大，洗脱能力越小。反相色谱受到最广泛应用的原因：在水中可以加入各种添加剂，改变流动相的离子强度、pH和极性等，以提高选择性。而且水的截止波长低，有利于痕量组分的检测。反相键合相稳定，不易被强极性组分污染。利用二次化学平衡，可以使不能直接用反相色谱分离的组分用反相色谱分离。《仪器分析》第八章++液相色谱分析反相色谱中的离子抑制法分离水溶液中可解离的弱酸弱碱时，通过调节流动相的pH来抑制解离，使分离改进的方法。流动相的pH应调节至比组分的pKa大（碱）或小（酸）两个单位以上。当弱酸的pKa在3

pKa

7之间、弱碱的pKa在7

pKa

8之间可采用离子抑制法。对于pKa<3的酸或者pKa>8的碱，可以采取离子对色谱法。《仪器分析》第八章++液相色谱分析离子对色谱离子对提取技术与色谱的结合。强极性电离型化合物在反相色谱体系中保留值很低，接近死时间流出来，直接用RP-HPLC分离困难。而离子交换色谱不能够同时分离离子型和非离子型样品，而且柱效不高。为了分离离子性化合物，Schill等将离子对萃取原理引入高效液相色谱，形成离子对色谱，又称为离子对分配色谱。《仪器分析》第八章++液相色谱分析

它是在色谱体系中加入一种与样品离子电荷相反的离子对试剂，通常称为对离子（counterion）。由于形成离子对、动态离子交换或者离子相互作用等第二种化学平衡，从而改变了样品离子在两相中的分配，使离子性溶质保留行为和分离选择性发生显著变化。

色谱系统中有机溶剂通过溶剂化使亲脂性离子对稳定性提高：《仪器分析》第八章++液相色谱分析影响离子对色谱保留值的因素：pH。离子对试剂的性质和浓度。溶剂化作用。离子强度和金属离子影响。随着离子强度的增加，离子对的保留值下降，而中性溶质的保留值趋于上升。温度。《仪器分析》第八章++液相色谱分析5离子交换色谱法（1）原理

离子交换色谱通过固定相表面带电荷的基团与样品离子以及流动相离子进行可逆交换、离子-偶极作用或吸附，实现色谱分离。不同组分离子对固定离子基团亲和力差别实现分离。柠檬酸根>SO42->C2O42->I->HSO4->NO3->CrO42->Br->SCN->Cl->HCOO->CH3COO->OH->F-Fe3+>Ba2+>Pb2+>Sr2+>Ca2+>Ni2+>Cd2+>Cu2+>Co2+>Zn2+>Mg2+>UO22+>Tl+>Ag+>Cs+>Rb+>K+>NH4+>H+>Li+《仪器分析》第八章++液相色谱分析（2）固定相

通常称为离子交换剂或者离子交换填料。根据交换剂的性质，有用于交换阳离子的阳离子交换剂和交换阴离子的阴离子交换剂。根据交换基团不同，分为强酸性阳离子、弱酸性阳离子、强碱性阴离子、弱碱性阴离子。离子交换树脂应用最广泛的离子交换树脂是苯乙烯型，它是在苯乙烯树脂上引入离子交换基团。硅胶化学键合离子交换剂为了克服离子交换剂树脂溶涨和被压缩的缺点，制备了各种硅胶键合离子交换剂。《仪器分析》第八章++液相色谱分析（3）流动相盐类缓冲溶液，影响保留值的因素：

pH

缓冲剂类型（淋洗离子电荷）离子强度有机溶剂添加剂配位剂：配体交换反应RM-L+X<——>RM-X+L《仪器分析》第八章++液相色谱分析（4）离子色谱法

电导检测器是离子交换色谱常用的检测器，然而，离子交换色谱淋洗液很多是强电解质，其电导比待测溶质高两个数量级，完全掩盖了待测离子信号。大多数无机离子没有紫外吸收，检测困难是妨碍离子交换色谱发展和应用的重要原因之一。1975年，Small等提出的离子色谱很好解决了这个问题。《仪器分析》第八章++液相色谱分析双柱离子色谱（抑制离子色谱）分离柱采用低容量交换剂，交换柱上分离机理和离子交换色谱相同。抑制柱反应是构成离子色谱高灵敏度个高选择性的重要基础。分离阳离子，一般用无机酸做淋洗剂，强碱性高容量阴离子交换剂做抑制柱，在抑制柱内产生两个重要反应：R+OH-+H+Cl-<---->R+Cl-+H2OR+OH-+M+Cl-<---->R+Cl-+M+OH-

流动相的无机酸与抑制柱反应生成水而除去，待测阳离子由盐转变成相应的碱。抑制反应的结果不仅降低了淋洗液电导，而且由于OH-的离子淌度是Cl-的2.6倍，同时提高了检测阳离子的灵敏度。《仪器分析》第八章++液相色谱分析

分离阴离子，一般用NaOH或者NaHCO3做淋洗剂，强酸性高容量阳离子交换剂做抑制柱，在抑制柱内产生两个重要反应：R-H++Na+OH-<---->R-Na++H2OR-H++Na+X-<---->R-Na++H+X-

淋洗液在抑制柱上反应，淋洗离子变成水或者碳酸（NaHCO3时），使本底电导大大降低。样品离子转变成相应的酸，而且由于H+的离子淌度是Na+的7倍，同时提高了检测阴离子的灵敏度。由于抑制柱积累了来自流动相的Na+

或Cl-离子，逐渐丧失抑制能力，必须经常用酸或碱再生。《仪器分析》第八章++液相色谱分析膜离子抑制器抑制柱必须再生，寿命短。为了克服这个缺点，采用具有磺酸基或季胺基团的聚苯乙烯多孔纤维制成的离子交换膜管，管内流过洗脱液，管外流过离子交换再生液。《仪器分析》第八章++液相色谱分析6尺寸排阻色谱法（1）原理

按照分子尺寸的差异进行分离的一种液相色谱方法，也称为凝胶色谱法。以水溶液为流动相称凝胶过滤色谱（GFC），有机溶剂为流动相称为凝胶渗透色谱（GPC）。VsVGVm《仪器分析》第八章++液相色谱分析凝胶色谱柱床的体积分布凝胶色谱柱床总体积VA包括填料骨架体积VG，填料孔穴体积VS和颗粒间体积Vm：VA=VG+VS+VmVT=VS+Vm固定相－凝胶色谱填料孔穴中VS的溶剂流动相－填料颗粒间的体积Vm

中的溶剂溶剂分子能够扩散进入填料孔穴。如果溶质分子足够小，也可以不同程度地向孔穴内扩散，占据一部分孔穴体积；如果溶质分子体积足够大，则不能扩散进入孔穴，被最先流出。《仪器分析》第八章++液相色谱分析Ve=Vm+VSa式中Ve是淋洗体积，即溶质保留体积，VSa是一定分子大小的溶质渗进孔穴所占的体积，是VS的一部分，是溶质分子量的函数。VSa和VS之比定义为分配系数KGPC：《仪器分析》第八章++液相色谱分析相对分子量校准曲线以相对分子量对保留体积作图。A排除极限B全渗透极限《仪器分析》第八章++液相色谱分析（2）固定相

常用的有无机和有机两类，5-10m。。多孔玻璃或硅胶：平衡快，耐高温，制造容易，孔径4-250nm。易产生吸附效应，需硅烷化处理。苯乙烯二乙烯基苯共聚物：孔径由交联剂二乙烯基苯的量来控制，疏水性，流动相必须是非水溶剂。在交联剂中引入亲水基团，如磺化二乙烯基苯等，可以得到亲水的共聚物。《仪器分析》第八章++液相色谱分析

孔径大小是非常重要的参数，它表明可分离的相对分子量的范围。《仪器分析》第八章++液相色谱分析（3）流动相

要求：能溶解样品，沸点比柱温高25-50C，粘度低，与样品折光率相差大。常用四氢呋喃、甲苯、氯仿、二甲基甲酰胺、水等。尺寸排阻色谱主要应用：分离蛋白质、核酸等测定高聚物的相对分子量分布研究聚合机理《仪器分析》第八章++液相色谱分析7分离模式选择与应用

从分子量、水溶性、极性和分子结构出发进行选择。样品分子量<2000分子量>2000水溶性非水溶性离子型离子交换色谱非离子型或可形成离子对腈基或氨基正相键合相色谱溶于非极性或弱极性溶剂（极性在CHCl3以下）溶于中等极性或极性溶剂（极性在CHCl3以上）C4、C8、C18及苯基反相键合相色谱腈基或氨基正相键合相色谱硅胶吸附色谱水溶性非水溶性离子型离子交换色谱非离子型或可形成离子对C4、C8、C18反相键合相色谱尺寸排阻色谱分子尺寸<30nm分子尺寸30~400nmC4、C8、C18反相键合相色谱尺寸排阻色谱溶于CHCl3溶于醇、乙酸乙酯分子尺寸<30nm分子尺寸30~400nm《仪器分析》第八章++液相色谱分析8超临界流体色谱法（1）原理

以超临界流体为流动相的色谱方法。纯物质的相图压力增大，流动相密度增加，溶剂力增大，保留值降低《仪器分析》第八章++液相色谱分析特点：结合气相色谱和液相色谱的优点，弥补它们的不足。可以分析气相色谱不适应的高沸点、低挥发性样品比液相色谱具有更快的分析速度和更高的柱效率。可以选用气相色谱、液相色谱用的检测器，与质谱、傅立叶变换红外光谱等在线联用也较方便复杂样品分析可以采取程序升密度的方式。《仪器分析》第八章++液相色谱分析（2）仪器

与气相色谱仪和高效液相色谱仪类似，但有以下不同：

SFC整个色谱仪体系都处在高压夏，必须有程序升压的精密控制设备。控温系统类似于GC，但更加精密。柱出口流体以气体形式释放，一般进入FID，因此，柱后必须装毛细管限流器，实现限流器两端的相的瞬间转变。毛细管限流器一般长约2-10cm、内径5-10

m。由于限流器两端的相转变过程属于吸热过程，为防止高沸点组分冷凝，限流器温度保持在约300-400C。

《仪器分析》第八章++液相色谱分析（2）固定相1.要求耐溶剂冲洗。