实验五-直接、间接血凝试验(兽医)

实验五凝集试验一、目的要求掌握直接凝集、间接凝集反应的原理掌握玻片凝集反应、试管凝集反应、微量间接血凝反应的操作方法与结果判定凝集反应的类型两大类直接凝集试验间接凝集试验玻片法：定性试管法：定量乳胶凝集试验碳素凝集试验间接血凝试验一、直接凝集反应的原理

凝集试验的发生分两阶段,当特异抗体与相应抗原颗粒相遇时，发生特异性的结合形成抗原抗体复合物，降低了抗原分子间的静电排斥力。第二步在电解质的参与下进一步中和复合物外层的电荷，从而聚集成较大的凝集块。通常，细菌和红细胞等颗粒性抗原在悬液中带弱负电荷,在悬液中相互排斥而呈均匀的分散状态。二、间接凝集实验原理将可溶性抗原（或抗体）先吸附于一种与免疫无关的、具有一定大小的不溶性颗粒（统称为载体颗粒）的表面，然后与相应抗体（或抗原）作用，在有电解质存在的适宜条件下，所出现的特异性凝集反应称为间接凝集反应，间接凝集试验由于载体颗粒增大了可溶性抗原的反应面积，因此当颗粒上的抗原与微量抗体结合后，就足以出现肉眼可见的凝集反应。常用的载体有红细胞（O型人红细胞、绵羊红细胞），聚苯乙烯乳胶颗粒，其次为活性炭、白陶土、离子交换树脂、火棉胶等。将可溶性抗原吸附到载体表面的过程为致敏以此建立的检测方法称为间接凝集试验。二、实验材料1.玻板凝集试验（1）玻片、移液枪、牙签等；（2）布氏杆菌平板凝集抗原、布氏杆菌标准阳性血清和阴性血清。2.试管凝集试验（1）试管（1㎝×8㎝）、试管架、恒温箱、各规格移液枪等；（2）布氏杆菌试管凝集抗原及布氏杆菌阳性血清、阴性血清；（3）被检血清；（4）灭菌0.5%石碳酸生理盐水。3.间接血凝试验1.96孔110°V型医用血凝板，与血凝板大小相同的玻板或塑料板。2.微量移液器（50微升25微升）取液塑料咀。3.微量振荡器。4.口蹄疫血凝抗原。5.口蹄疫阴性对照血清。6.口蹄疫阳性对照血清。7.稀释液。8.待检血清。9.湿盒三、操作方法1.玻板凝集试验（1）在洁净玻片上，各加15μL布氏杆菌阳性血清、阴性血清、待检血清与生理盐水。

（2）加入布氏杆菌平板抗原15μL，滴在血清附近，不与血清接触。用牙签将血清与抗原混匀，轻轻摇动玻板使液滴呈旋状运动。阴性血清阳性血清生理盐水待检血清2.试管凝集试验（1）取试管八支，按下表加入生理盐水；（2）取布氏杆菌血清进行梯度稀释；（3）加入布氏杆菌检测抗原；（4）充分混匀，置37℃温箱24小时。单位(ml)3.间接血凝试验（微量法）的具体操作步骤（1）平板凝集试验结果判定：

出现颗粒状或块状凝集者为阳性反应；未出现凝集者为阴性反应。（2）试管凝集实验结果判定：判定标准：

出现“++”以上的凝集现象的最高血清稀释度为血清的凝集价牛、马和骆驼于1：100稀释度，猪、山羊和犬于1：50稀释度出现“++”以上凝集现象时，被检血清应判定为阳性反应。牛、马和骆驼于1：50，猪、养和犬于1：25稀释度出现“++”以上凝集现象时，应判为可疑反应。（3）间接血凝试验结果判定红细胞成薄层凝集，布满整个孔底或边缘卷曲呈荷叶边状为100%凝集，记录为“#";红细胞成薄层凝集，但面积较小，中心比较致密，边缘松散，即为50%凝集，记录为“++”，介于上述两者之间为75%凝集，记录为“+++”；红细胞大部分集中于中央，周围有少量凝集为25%