医学免疫学第22章-免疫学检测技术

第二十二章免疫学检测技术P193复习抗原和抗体可以发生高度专一性的结合

抗原和抗体可以发生高度专一性的结合抗原和抗体可以发生高度专一性的结合抗原或抗体检测原理：借助抗原和抗体在体外特异结合后出现的各种现象，对标本中的抗原或抗体进行定性或定量的检测。Equivalence–Latticeformation抗原和抗体可以发生高度专一性的结合抗原或抗体检测原理一种细菌可以刺激多少种抗体产生？抗原抗体（Antibody)抗体（Antibody，Ab)免疫球蛋白的双重性免疫球蛋白是一种蛋白质，是抗体(Ab1)；同时又可引起机体产生抗体（抗抗体,Ab2），所以既是抗体又是抗原。

AgAb1Ab2

免疫学检测技术主要应用：对多种免疫性疾病的诊断、疗效评估、发病机制探讨;对抗原性物质、免疫细胞、细胞因子、粘附分子或细胞受体等的定性、定量检测。第一节体外抗原抗体结合反应

的特点及影响因素

抗原-抗体反应包括：沉淀反应、凝集反应、溶解反应、补体结合反应、中和反应等。

抗原-抗体反应可用已知的特异性抗体检测未知的抗原；也可用已知的抗原检测未知的抗体。免疫标记技术包括：免疫酶技术、免疫荧光技术、同位素标记技术、化学发光免疫技术、免疫胶体金技术等。（一）抗原-抗体反应的特点：P1931.高度特异性：抗原-抗体的特异性结合。2.

可逆结合：抗原抗体分子表面的非共价键结合。4.反应的两个阶段：

特异性结合阶段；可见的反应阶段。3.

浓度和比例：是否呈现可见的反应现象，与抗原和抗体两者的分子浓度和比例密切相关。抗原抗体比例对反应现象的影响（二）抗原-抗体反应的影响因素1.电解质：抗原-抗体反应通常应用0.85%的氯化钠（适当浓度的电解质）作为稀释液。2.温度：反应常在37℃水浴或孵育箱中进行。3.酸碱度：抗原-抗体反应适应的酸碱度

为pH6-8。抗原-抗体反应受多种因素影响第二节检测抗原或抗体的体外试验凝集反应沉淀反应（中和反应）免疫标记技术：用标记抗体或抗原进行的抗原抗体反应蛋白质芯片技术一、凝集反应

(Agglutination)

细菌、红细胞等颗粒性抗原与相应抗体结合、凝集的现象。1、直接凝集：将细菌或红细胞与相应的抗体直接反应，出现细菌凝集或红细胞凝集现象。又分为玻片法（定性试验）和试管法（半定量试验）。常见血清学检测1.凝集反应直接凝集反应1:2稀释待测血清1:41:81:16细菌、细胞等颗粒性Ag或表面包被抗原的颗粒状物质与相应Ab在电解质存在的情况下结合，出现肉眼可见的凝集团现象。玻片法试管法常用于菌种鉴定或ABO血型鉴定常用于检测抗体的滴度或效价，见于临床诊断伤寒或副伤寒所用的肥达氏反应和诊断布氏菌病所用的瑞特试验。一、凝集反应

(Agglutination)2、间接凝集：将可溶性抗原包被在红细胞或乳胶颗粒表面，形成致敏颗粒，与相应抗体反应出现的颗粒凝集现象。间接凝集反应将可溶性Ag/Ab先吸附在某些颗粒载体上，形成致敏颗粒，然后再与相应Ab/Ag进行反应产生凝集，叫间接凝集反应。如将溶血毒素O吸附于乳胶颗粒上的抗“O”试验、人IgG作为Ag吸附于乳胶颗粒上的类风湿因子检测。凝集反应常用于溶血性疾病的诊断：+YYYYYYYYYYYY病人的RBC体内anti-Rh由于抗体多属于IgG，分子量较小，抗体与红细胞间的结合力不能克服细胞间的排斥力，不出现凝集+YYYYYYYYYYYYYY+Y体外加入抗人IgG出现凝集现象，叫直接库姆试验正常人O型血的Rh+的RBC+YYYY患者血清内的游离anti-Rh+Y体外加入抗人IgGYYYYYYYYYYYYYY出现凝集现象，叫间接库姆试验血球凝集二、沉淀反应

（Precipitation)

血清蛋白质、细胞裂解液或组织浸液等可溶性抗原与相应抗体结合后出现沉淀物，称为沉淀反应。沉淀反应AgAgAgAgAbingel单向免疫扩散Ag1AbAg2Ag3Ag4双向免疫扩散免疫比浊过量AbAbAbAb毒素、组织浸液及血清中的蛋白等可溶性抗原与相应抗体反应后，出现肉眼可见的沉淀物，称为沉淀反应。沉淀反应可在液体中进行，也可在半固体琼脂凝胶中进行。鉴定多种抗原是完全相同、部分相同或完全不同用于确定抗原浓度沉淀反应—免疫电泳存在于不同区域的抗原与抗体结合，在比例适宜处形成沉淀弧。沉淀弧的数量、位置和形状与标准品相对比，可分析样品的成分及其性质。1.单向免疫扩散

(SingleImmunodiffusion)将一定量已知抗体混于琼脂凝胶中制琼脂板；打孔，将抗原加入孔中扩散。抗原与抗体相遇，形成沉淀环，环的直径与抗原含量成正比。常用于测定血清IgG、IgM、IgA和C3等的含量。含抗体的凝胶沉淀环2.双向免疫扩散

（DoubleImmunodiffusion)将抗原与抗体分别加入琼脂凝胶的小孔中，二者自由扩散并相遇，在比例合适处形成沉淀线。含两种以上的抗原抗体系统，可出现两条以上的沉淀线。常用于抗原或抗体的定性、组成和两种抗原相关性分析的检测。3.免疫电泳

（Immunoelectrophoresis)将待测血清标本作琼脂凝胶电泳，不同分子量蛋白组分开，然后与电泳方向平行挖一小槽，加入相应的抗血清，与不同区带的蛋白抗原作双向免疫扩散，在各区带相应的位置形成沉淀弧。常用于血清蛋白种类分析。4.火箭电泳（RocketElectrophoresis)也称免疫扩散，是把单向免疫扩散同电泳结合在一起的方法。抗原在含有定量抗体的琼脂中泳动，两者比例适宜时，在较短时间内生成锥形的沉淀峰。在一定浓度范围内，沉淀峰的高度与抗原含量成正比。特点：需时较短，用于快速沉淀标本中抗原含量的测定。火箭电泳示意图3.免疫标记技术P194检测原理通过免疫学中抗原抗体结合反应，用特异性抗体(单克隆或多克隆)或抗原检测组织、细胞内相应的抗原或抗体物质，形成抗原-抗体复合物；利用此复合物上带有预先标记的标记物，通过与标记物相对应的检测系统，如酶底物显色反应可使之呈现某种颜色，从而可检测组织细胞内的抗原，以达到诊断、鉴别诊断和研究的目的。可作为抗原的物质有酶、受体、抗体、细胞外基质激素、细胞结构蛋白、病原体。免疫标记物显色原理（1）免疫酶测定法（2）免疫荧光技术（3）放射免疫测定法（4）发光免疫分析（5）免疫胶体金技术（6）免疫印迹技术（1）免疫酶测定法夹心法ELISA间接ELISABAS—ELISA利用生物素和抗生物素蛋白为桥梁微粒捕获酶免疫分析技术将已知特异性抗体致敏的免疫微粒与生物素、亲和素、酶相结合，最后酶作用于荧光底物发光，通过检测荧光强度判断未知抗原的含量。a）b）免疫组化技术定位、定性、定量检测（2）免疫荧光技术P195将荧光素（异硫氰酸荧光素，FITC、藻红蛋白，PE)与抗体连接成荧光抗体，再与待测标本的抗原反应，置荧光显微镜下观察，抗原抗体复合物散发出荧光，对标本中抗原的鉴定和定位。包括直接荧光法、间接荧光法和补体法。直接荧光法：将荧光素直接标记抗体作标本染色。优点：是特异性强。缺点：每检测一种抗原必须制备相应的荧光抗体。间接荧光法：用一抗与标本中的抗原结合，再用荧光素标记的二抗染色。优点：敏感性比直接法高，制备一种荧光素标记的二抗可用于多种抗原的检测。补体结合免疫荧光法：在间接法的第一步抗原-抗体反应时加入补体，使之与抗原-抗体复合物结合；再用荧光素标记的抗C3抗体进行示踪。间接免疫荧光法示意图免疫荧光显微技术海马细胞微管蛋白绿色(胞体、树突)

轴突终末蛋白红色(突触)

培养的成纤维细胞微管呈绿色核呈蓝色流式细胞术（FlowCytometry,FCM)

FCM是将免疫荧光技术应用于流式细胞仪，对单个细胞的表面标志（抗原或受体）进行快速、精确的分析和自动检测，并将不同类型的细胞分选收集。FCM还可对同一细胞的多种参数（如DNA、RNA、蛋白质和细胞体积等）进行多信息分析。流式细胞术流式细胞仪工作原理（3）放射免疫测定用放射性核素标记抗原或抗体进行的免疫测定。将同位素的敏感性与抗原抗体结合的特异性结合起来，具有重复性好、准确性高等优点，广泛应用于激素、药物等微量物质的检测。常用的有131I、125I。放射免疫测定法

(Radioimmunoassay,RIA)用放射性核素标记抗原进行的免疫学检测技术。放射性核素显示的高灵敏性，使检测的敏感性达pg水平。常用于标记的放射性核素有I125和I131。常用于胰岛素、生长激素、药物等微量物质的测定。（4）化学发光免疫技术P196将化学发光分析和免疫反应相结合而建立的一种新的免疫分析技术。最常用的发光物质是鲁米诺。灵敏度高、简便、可实现自动化分析。化学发光免疫测定生物发光免疫测定化学发光酶免疫测定电化学发光免疫测定⑤免疫胶体金技术用胶体金颗粒标记Ab/Ag，以检测未知Ag/Ab的方法。氯金酸在还原剂作用下，可聚合成特定大小的金颗粒，形成带负电的疏水胶溶液，因静电作用而呈稳定的胶体状态。该技术可应用于免疫组化(光镜下检查)和免疫层析快速诊断。⑥免疫印迹法-Westernblotting免疫印迹法（Immunoblotting）将凝胶电泳与固相免疫测定结合，先把电泳分区的蛋白质转移到固相载体，再用酶免疫、放射免疫等技术测定。能分离分子大小不同的蛋白质并确定其分子量。常用于检测多种病毒（如HIV）的抗体或抗原。免疫印迹法示意图生物芯片基因芯片蛋白质芯片微流控芯片蛋白质芯片,又称蛋白质阵列或蛋白质微阵列，是指以蛋白质分子作为配基,将其有序地固定在固相载体的表面形成微阵列；用标记了荧光的抗体或其他它分子与之作用，洗去未结合的成分，经荧光扫描等检测方式测定芯片上各点的荧光强度，荧光强度将指示蛋白质对应抗体及其相互结合的程度。微生物检测、肿瘤筛查。

4.蛋白质芯片技术研究蛋白质芯片的意义蛋白质是基因表达的最终产物,接近生命活动的物质层面；探针蛋白特异性高、亲和力强,可简化样品前处理，甚至可直接利用生物材料(血样、尿样、细胞及组织等)进行检测；适合高通量筛选与靶蛋白作用的化合物；有助于了解药物或毒物与其效应相关蛋白质的相互作用。蛋白质检测芯片

蛋白质功能芯片

蛋白质芯片的分类PoetzOet.al,MechanismsofgeingandDevelopment,2005,126,161–170.第三节免疫细胞功能的检测

（自学+实验）（P197-202）检测各种淋巴细胞的数量与功能是观察机体免疫状态的重要手段。外周血是病人主要的检测标本，但仅代表再循环的淋巴细胞。实验动物还可取胸腺、脾、淋巴结等作为标本进行检查。(1)抗凝静脉血(2)加等量NS(4)密度梯度离心血浆分离液RBCPBMCPMN(3)混匀后，缓慢加于分离液上T细胞功能测定体外法：T细胞增殖试验形态学检查

3H-TdR掺入法

MTT法体内法：用生物抗原或化学抗原作皮内试验。OT-PPD皮试

一、T细胞功能的检测T细胞增殖试验T细胞分泌功能测定T细胞介导的细胞毒试验体内试验（一）T淋巴细胞增殖试验1.原理：淋巴细胞DNA合成分化母细胞刺激物细胞变大细胞浆扩大空泡核仁明显核染色质疏松

未转化和转化淋巴细胞的形态特征转化的淋巴细胞未转化的淋巴细胞淋巴母细胞过渡型细胞大小(直径μm)12～2012～166～8核大小、染色质增大、疏松增大、疏松不增大、密集核仁清晰、1～4个有或无无有丝分裂有或无无无胞质、着色增多、嗜碱增多、嗜碱极少、天青色浆内空泡有或无有或无无伪足有或无有或无无2.淋巴细胞转化的刺激物非特异性刺激物：

PHA------T细胞

ConA-------T细胞

PWM-------T、B细胞

LPS-------B细胞特异性刺激物：异种抗原同种组织抗原

3.检测方法

形态法：刺激物淋巴细胞（4-6天）母细胞化同位素法：PHA淋巴细胞（54h）

DNA合成期+3HTdR掺入

收集细胞

检测β射线

测定细胞内的3H－TdR（1）形态学检查法方法学评价：优点：形态学方法简便易行，普通光学显微镜便能观察结果，适于基层实验室应用。缺点：是依靠肉眼观察形态学变化，判断结果易受主观因素影响，重复性和准确性较差。培养液3H-TdRPHA淋巴细胞全血分层液离心过滤测量放射性（2）3H-TdR掺入法优点：3H-TdR掺入法敏感性高，客观性强，重复性好。缺点：但需一定设备条件，同时还存在放射性核素污染问题。培养液3H-TdRPHA淋巴细胞全血分层液离心过滤测量放射性MTT测吸光度(3)MTT比色法(二)T细胞分泌功能测定

体外培养的T细胞经各种丝裂原或抗原刺激后,分泌各种细胞因子,可借助免疫学、细胞生物学及分子生物学技术分别检测细胞因子含量、生物学活性或基因表达水平，以反映T细胞功能。

（三）T细胞介导的细胞毒试验1.原理：靶细胞抗原T细胞观察杀伤活力致敏CTL靶细胞形态学方法：淋巴细胞+肿瘤细胞计数残留肿瘤细胞2.方法意义：肿瘤患者CTL杀伤肿瘤细胞的能力

图15-2T细胞细胞毒试验示意图靶细胞51Cr洗涤去除游离的51Cr效应细胞测量上清液中释放的51Cr混合培养4-6小时51Cr释放法(四)体内试验特异性抗原皮肤试验PHA皮肤试验二、B细胞功能检测B细胞增殖能力的试验溶血空斑试验B细胞抗体形成功能的检测体内试验(一)B细胞增殖能力的试验抗IgM细菌脂多糖SAC的SPA

B细胞增殖形态学3H－TdR掺入法(二)溶血空斑试验1.原理：2.方法学：经典溶血空斑形成试验被动溶血空斑试验

3．临床应用与评价溶血空斑试验主要用于测定药物和手术等因素对体液免疫功能的影响评价免疫治疗或免疫重建后机体产生抗体的能力。

(三)

B细胞抗体形成功能的检测

——酶联免疫斑点法1.原理：2．应用与方法学评价：该方法既可检测抗体分泌细胞，又可检测抗体分泌量。优点：稳定、特异、抗原用量少；可同时检测不同抗原诱导的不同抗体分泌，并可定量；可检测组织切片中分泌抗体的单个细胞。(四)体内试验体内抗体产生的特异性抗原有白喉类毒素、破伤风类毒素、多价肺炎链球菌菌苗等。将适量抗原皮下或肌肉注射免疫，并于免疫前及免疫后1周、2周、3周分别采血，分离血清，测定受检者免疫前后相应抗体的效价，判断受检者体内B细胞的功能。染色计数离心取上清测LDH或AKP离心取沉淀测活细胞荧光测发光强度测CPM值形态法酶释法荧光法同位素法化学发光法三、NK细胞活性测定靶细胞溶解常用靶细胞:

K562细胞株培养液3H-TdRPHA淋巴细胞全血分层液离心过滤测量放射性淋巴细胞增殖试验（3H-TdR掺入法）示意图靶细胞51Cr洗涤去除游离的51Cr效应细胞测量上清液中释放的51Cr混合培养4-6小时细胞毒试验（51Cr释放法）示意图：（Na51CrO4标记靶细胞）细胞毒试验（乳酸脱氢酶释放法）

正常情况下，乳酸脱氢酶（LDH）存在于细胞内，细