《蛋白表达纯化》课件

蛋白表达纯化本课程旨在介绍蛋白表达纯化的基本原理和技术，帮助学生了解蛋白表达纯化的流程和步骤，掌握常用方法和技巧。蛋白质及其重要性生命的基本构成蛋白质是生命体的重要组成部分，参与几乎所有生命活动。结构与功能蛋白质具有多种多样的结构和功能，如催化酶反应、运输物质、免疫防御等。蛋白质结构层次1一级结构氨基酸序列2二级结构α螺旋和β折叠3三级结构空间三维结构4四级结构多个多肽链组装蛋白质的主要功能催化酶是蛋白质，它催化生物体内的化学反应。例如，消化酶分解食物，而合成酶制造新的分子。免疫抗体是一种蛋白质，它识别并中和外来物质，例如细菌和病毒。抗体是免疫系统的重要组成部分。运输运输蛋白通过细胞膜运输物质，例如营养物质、氧气和废物。例如，血红蛋白将氧气从肺部运送到全身的细胞。蛋白质的表达和纯化1蛋白质表达将目的基因导入合适的宿主细胞，并通过细胞的蛋白质合成系统表达目的蛋白。2蛋白质纯化从宿主细胞中分离出目的蛋白，并去除其他杂质蛋白。3蛋白质鉴定确认所获得的蛋白质是目标蛋白质，并评估其纯度和活性。表达系统概述大肠杆菌酵母昆虫细胞哺乳动物细胞大肠杆菌表达系统大肠杆菌表达系统是应用最广泛的表达系统之一，具有以下优点：培养成本低生长速度快遗传背景清楚，操作方便可进行高密度培养，产量高酵母表达系统酵母表达系统是一种常用的蛋白质表达系统。酵母菌是真核生物，具有真核生物的翻译后修饰机制，可以表达折叠正确、具有生物活性的蛋白质。酵母表达系统具有以下优点：1.酵母菌生长迅速，培养成本低。2.酵母菌可以进行糖基化修饰，表达具有生物活性的蛋白质。3.酵母表达系统可以进行基因工程改造，提高蛋白质的表达水平。昆虫细胞表达系统昆虫细胞表达系统是一种常用的蛋白质表达系统，它具有以下优点：可以表达真核蛋白质，包括复杂的蛋白质，并进行翻译后修饰。能够获得高水平的蛋白质表达。易于操作和放大，适合工业化生产。哺乳动物细胞表达系统哺乳动物细胞表达系统以其能正确折叠和修饰蛋白质而闻名。这种系统适用于生产复杂药物蛋白和疫苗。它可以提供人类蛋白质的正确翻译后修饰，如糖基化，磷酸化和酰化，这些修饰对于蛋白质功能至关重要。蛋白质纯化的工艺流程细胞裂解破坏细胞膜，释放目标蛋白粗提去除细胞碎片和杂蛋白层析分离利用目标蛋白的物理化学性质进行分离纯化浓缩和脱盐提高蛋白浓度，去除盐类等杂质纯度和活性检测确认目标蛋白的纯度和生物活性蛋白质纯化的关键步骤1蛋白质溶解和裂解将目标蛋白从细胞中释放出来，并将其溶解在合适的缓冲液中。2蛋白质初步分离去除杂质蛋白，例如细胞碎片和核酸，以提高纯度。3层析技术利用不同的分离原理，将目标蛋白从其他蛋白中分离出来。4蛋白质浓缩和脱盐去除多余的缓冲液，并提高蛋白浓度。蛋白质溶解和裂解1细胞裂解通过物理或化学方法破坏细胞膜，释放出目标蛋白。2溶解选择合适的缓冲液，使目标蛋白溶解并保持活性。3去除细胞碎片通过离心或过滤等方法，去除细胞碎片和杂质。蛋白质初步分离1离心去除细胞碎片2盐析利用蛋白质溶解度差异3热处理去除热不稳定蛋白层析技术概述分离原理利用物质在固定相和流动相之间的分配系数不同进行分离。应用范围广在生物化学、医药、食品等领域有着广泛的应用。种类多样包括离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等。离子交换层析原理利用蛋白质表面带电荷的差异，将蛋白质吸附在带相反电荷的离子交换树脂上，然后通过改变缓冲液的离子强度或pH值，将蛋白质洗脱下来。分类阳离子交换层析阴离子交换层析应用离子交换层析广泛用于蛋白质的纯化，例如去除盐类、杂蛋白和核酸等。亲和层析利用靶蛋白与配体之间的特异性亲和力进行分离。配体可为抗体、酶、受体、金属离子等。通过洗脱步骤，分离目标蛋白。凝胶渗滤层析1分离原理根据蛋白质分子大小不同进行分离。2凝胶类型常用的凝胶包括Sephadex、Sepharose和Superdex等。3应用范围适用于蛋白质脱盐、纯化和分子量测定。蛋白质浓缩和脱盐浓缩浓缩是将目标蛋白溶液中的水分去除，提高蛋白浓度。脱盐脱盐是去除溶液中的盐分，通常采用透析或凝胶过滤等方法。蛋白质的活性检测酶活性检测通过测定酶催化特定底物的转化速率来评估酶的活性。抗体活性检测通过测定抗体与抗原结合的能力来评估抗体的活性。受体结合检测通过测定受体与配体结合的能力来评估受体的活性。蛋白质的产量分析1产量根据实验条件和蛋白表达水平，评估蛋白质的产量。2纯度通过SDS或其他方法，评估蛋白质的纯度。3活性通过酶活性或其他生物活性测定，评估蛋白质的活性。蛋白质纯度分析常见的蛋白质纯度分析方法包括SDS、HPLC和质谱。蛋白质的结构表征一级结构氨基酸序列，决定蛋白质的折叠方式和功能。二级结构局部结构，如α螺旋和β折叠，形成蛋白质的骨架。三级结构蛋白质的整体三维形状，由二级结构之间的相互作用决定。四级结构多个蛋白质亚基组成的复杂结构，形成功能蛋白。蛋白质的功能鉴定酶活性测定通过检测酶催化特定反应的速度或产物生成量来确定酶的功能。基因敲除或过表达通过敲除或过表达目标基因，观察对细胞或生物体功能的影响来推断蛋白质的功能。蛋白质相互作用研究通过酵母双杂交、免疫共沉淀等方法研究蛋白质之间的相互作用来确定蛋白质的功能。蛋白质应用领域药物蛋白的开发蛋白质药物的开发是目前生物制药领域的重要方向之一。利用蛋白质的生物活性，可以开发出针对特定疾病的药物。疫苗蛋白的研发蛋白质疫苗的研发是预防疾病的重要手段。利用蛋白质抗原，可以刺激机体产生免疫应答，从而预防疾病的发生。工业酶的生产蛋白质酶在工业生产中发挥着重要的作用，例如在食品加工、洗涤剂、生物燃料等领域。药物蛋白的开发治疗性抗体针对特定疾病靶点的抗体，如肿瘤治疗的单克隆抗体。激素和生长因子用于治疗荷尔蒙失衡或促进生长发育的蛋白质，如胰岛素和生长激素。酶催化特定生化反应的蛋白质，用于治疗遗传疾病或代谢紊乱。疫苗蛋白的研发1抗原蛋白疫苗蛋白通常是病原体的抗原蛋白，可以刺激机体产生特异性免疫反应。2免疫策略疫苗蛋白可以采用不同的免疫策略，例如灭活疫苗、亚单位疫苗、重组蛋白疫苗等。3安全性疫苗蛋白的研发需要严格的安全评估，确保其安全性和有效性。工业酶的生产酶催化反应工业酶通过催化特定化学反应，加速生产过程，提高效率。食品加工用于食品加工，例如淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶，用于提高产品质量，延长保质期。洗涤剂洗涤剂中使用的酶，例如蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶，可以有效地分解污渍。总结与展望1技术进步