第八单元-基因工程的基本操作程序(教师版)高二生物单元复习知识清单

第三章基因工程第二节基因工程的基本操作程序1.基因工程的基本操作程序：(1)目的基因的筛选与获取;(2)基因表达载体的构建（核心）;(3)将目的基因导入受体细胞;(4)目的基因的检测与鉴定。（P76）一、目的基因的筛选与获取1．目的基因的概念：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。（P76）2.根据不同的需要，目的基因是不同的，主要是指编码蛋白质的基因。（P76）3.常见目的基因类型：与生物抗逆性、优良品质、生产药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。实例：培养转基因抗虫棉用到的目的基因是Bt抗虫蛋白基因。（P76）4．筛选合适的目的基因较为有效的方法：从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选。实例：在培育转基因抗虫棉之前，科学家不仅掌握了Bt基因的序列信息，也对Bt基因的表达产物——Bt抗虫蛋白有了较为深入的了解。（P76）5.认识基因结构和功能的技术方法：DNA测序技术、遗传序列数据库（GenBank）、序列比对工具（如BLAST）等的应用，越来越多的基因的结构和功能为人们所知，为找到合适的目的基因提供了更多的机会和可能。（P77）6.Bt抗虫蛋白的抗虫原理是什么？（P77相关信息）当Bt抗虫蛋白被分解为多肽后，多肽与害虫肠上皮细胞的特异性受体结合，导致细胞膜穿孔，最后造成害虫死亡。7.为什么Bt抗虫蛋白不会对人畜产生危害？（P77相关信息）Bt抗虫蛋白只有在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，肠道细胞也没有特异性受体，因此，Bt抗虫蛋白不会对人畜产生上述影响。8.获取目的基因的方法：PCR扩增、构建基因文库、化学方法人工合成。（P82）9.PCR的概念：PCR是聚合酶链式反应的缩写，它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。（P77）（1）全称：聚合酶链式反应。（2）原理：DNA半保留复制。（3）操作环境：体外（PCR扩增仪/PCR仪）。（4）目的：对目的基因的核苷酸序列进行大量复制。（5）优点：可以在短时间内大量扩增目的基因。10.PCR由穆里斯等人于1985年发明，并于1993年获得诺贝尔化学奖。（P77）11.条件：DNA模板、分别与两条模板链结合的2种引物、四种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶。（P77）12.PCR的过程：目的基因DNA受热变性后解为单链，引物与单链相应互补序列结合；然后以单链DNA为模板在（耐高温的）DNA聚合酶作用下进行延伸，即将4种脱氧核苷酸加到引物的3’端，如此重复循环多次。每次循环一般可以分为变性、复性、延伸三步。（P77）(1)变性：温度上升到90℃以上，目的基因DNA受热变性后解为单链。该过程中打开的是哪种化学键是氢键。（P78）(2)复性：温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。该过程碱基互补配对的一定是引物与模板链吗？不一定，也可能出现引物与引物配对（设计问题）、模板链配对。（P78）(3)延伸：温度上升到72℃左右时，溶液中四种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下加到引物的3′端合成子链。（P78）(4)重复循环多次。(5)结果：呈指数形式扩增（n次扩增循环后，DNA数量约为2n)。13.为什么呈指数形式扩增？一个循环得到的产物可以作为下一个循环的模板，因而每一次循环后目的基因的量可以增加一倍。14.DNA体内复制解旋条件为解旋酶，PCR解旋条件为90℃以上高温；15.DNA体内复制合成DNA子链需要DNA聚合酶催化，PCR合成DNA子链需要耐高温的DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶）催化。16.PCR的扩增缓冲液中一般含有Mg2+作用为激活DNA聚合酶。（P77相关信息）17.PCR中复制的原料实际为dNTP（dATP、dTTP、dCTP、dGTP）除作为原料，还可以水解产生能量为合成DNA子链提供能量。因此，PCR反应体系中不需要添加ATP。18.引物是一小段能DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。（P77相关信息）*体内复制的引物为RNA单链，PCR中的引物一般为DNA单链。19.引物的作用：使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸。（P77）20.为什么需要引物？DNA复制不能从头开始，DNA聚合酶只能从引物的3'端延伸DNA链.（DNA聚合酶只能催化单个核苷酸加到已有核苷酸片段的3’端的羟基上）21.两种引物都结合在DNA模板链的3’端，脱氧核苷酸连接在引物的3’端进行延伸。22.DNA新链延伸的方向为从5’端向3’端延伸。（P78图）23.DNA复制需要一定的液体环境和pH，PCR中由缓冲溶液提供。24.PCR的产物通常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定。（P79）思考：用PCR可以扩增mRNA吗？mRNA不可以直接扩增，需要将它逆转录成cDNA再进行扩增。（1）逆转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA链，形成RNA-DNA杂交分子；（2）核酸酶H降解RNA-DNA杂交分子中的RNA链，使之变成单链DNA；（3）以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子，即cDNA。引物（1）设计引物的依据是：目的基因两端的核苷酸序列。（2）引物设计时既要考虑目的基因序列，又要考虑载体序列，原因是：为了便于扩增的DNA片段与表达载体连接，需在引物的5’端加上限制酶的酶切位点。（3）使用的一对引物的序列相同吗？不相同，目的基因两端具有不同的核苷酸序列。*两种引物才能确保DNA的两条链同时被扩增（4）引物设计的要求（或引物失效的原因）a.每种引物内部不能发生局部碱基互补配对。b.两种引物之间不能在局部发生碱基互补配对。（5）每种引物内部不能发生局部碱基互补配对的原因：防止引物自身折叠。（6）两种引物之间不能在局部发生碱基互补配对的原因：防止引物之间配对，导致引物不能同模板链结合。（8）引物长度一般为20-30个核苷酸，若引物长度过短，则引物与模板链结合的特异性较差。PCR与体内DNA复制的比较：PCR技术DNA复制相同点原则碱基互补配对条件DNA母链作为模板、引物、4种脱氧核苷酸为原料（实为dNTP）延伸方向新链都是从5’端向3’端延伸不同点解旋方式90℃以上高温解旋解旋酶催化场所体外-PCR扩增仪（PCR仪）体内-主要在细胞核延伸用酶耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）DNA聚合酶温度控制温度，需要在不同温度下进行（90℃以上变性、50℃左右复性、72℃左右延伸）体内温和条件过程结果大量的DNA片段（目的基因）形成完整的子代DNA25.基因文库分为两类：基因组文库和部分基因文库（如cDNA文库）。（P82）26.cDNA文库比基因组文库小；cDNA文库中的基因无启动子、终止子和内含子；基因组文库中的基因有启动子、终止子和内含子。27.cDNA概念：某种生物发育的某个时期的mRNA逆转录产生的多种互补DNA片段。28.形成cDNA的过程中需要逆转录酶。29.真核生物的cDNA为什么没有内含子和启动子？cDNA是由生物发育的某个时期的mRNA逆转录产生的DNA片段，启动子位于非编码区，不会转录形成mRNA的片段，而内含子转录之后，会经后期加工，其对应的RNA序列会被剪切掉，因此在mRNA中不含有启动子和内含子对应的RNA序列，那么经过逆转录得到的DNA中，也就没有相应的序列。30.为什么cDNA文库中含有的基因数目比基因组文库中的少？cDNA文库中只含有该生物在某个时期已表达的基因，而基因组文库中含有该生物的全部基因。31.利用化学方法合成DNA需要仪器为DNA合成仪；要求基因的核苷酸序列已知；该过程不需要模板。二、基因表达载体的构建1.地位：基因表达载体的构建这一步是基因工程的核心工作。（P80）2.构建基因表达载体的目的：(1)使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代。(2)使目的基因能够表达和发挥作用。（P80）3.基因表达载体的组成：基因表达载体必须包括目的基因、标记基因、启动子、终止子等（若需要能完成自主复制，还应有复制原点）。4.启动子：（P80）（1）本质：一段有特殊序列结构的DNA片段。（2）位置：位于基因的上游，紧挨转录的起始位点。（3）功能：RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出mRNA。（4）特殊类型：诱导型启动子。（5）诱导型启动子的特点：当诱导物存在时，可以激活或抑制目的基因的表达。5.终止子：（P80）（1）本质：一段有特殊序列结构的DNA片段。（2）位置：位于基因的下游。（3）功能：使转录在所需要的地方停下来。6.标记基因（1）作用：便于重组DNA分子的筛选。（2）常见类型抗生素抗性基因、荧光蛋白基因等7．基因表达载体的构建过程：首先用一定的限制酶切割载体，使它出现一个切口；然后用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割目的基因的DNA片段（使之产生平末端或相同的黏性末端）；再利用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体的切口处。这样就形成了一个重组DNA分子。（P80）8.切割载体和切割含有目的基因的DNA片段的限制酶为什么应为同种限制酶或能产生相同末端的限制酶？产生相同的黏性末端或平末端，以便通过DNA连接酶连接。9.用同一种限制酶切割质粒和含有目的基因的DNA，再用DNA连接酶处理后，一定会形成重组DNA分子吗？不一定，载体和目的基因都可能出现自身环化。10.用同一种限制酶切割质粒和含有目的基因的DNA，再用DNA连接酶处理后，可能有几种产物？自连（目的基因自身环化、载体自身环化）两两连接（目的基因与目的基因连接、载体与载体连接、目的基因与载体连接）。11.用同一种限制酶切割质粒和含有目的基因的DNA，再用DNA连接酶处理后，形成的“载体-目的基因”产物一定符合要求吗？不一定，目的基因可能反向连接到质粒上。12.如何避免上述问题？同时用两种限制酶切割含目的基因的DNA片段和载体。13.将生物的所有DNA直接导入受体细胞不是更简便吗？如果这么做，效果会怎样？这种方法针对性差，完全靠运气，也无法确定哪些基因导入了受体细胞。14.由于不同转基因产品所需要的目的基因不同，受体细胞又有植物、动物、微生物之分，因此基因表达载体的构建方法不是千篇一律的,将目的基因导入受体细胞的方法也不是完全相同的。三、将目的基因导入受体细胞1．目的基因导入受体细胞的方法(1)目的基因导入植物细胞（P80）①花粉管通道法Ⅰ.用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中。Ⅱ.在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借花粉管通道进入胚囊。=3\*ROMANIII.花粉管通道法的受体细胞：受精卵。=4\*ROMANIV.花粉管通道法的地位：我国科学家独创（将Bt基因导入棉花细胞）。②农杆菌转化法（P81资料卡）转化：目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞内维持稳定和表达的过程。Ⅰ.农杆菌的特点：农杆菌自然条件下侵染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有侵染能力；农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T-DNA（可转移的DNA）转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。（P81）Ⅱ.农杆菌转化法的实验思路（过程）：将目的基因插入Ti质粒的T-DNA中，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入植物细胞，（P81）并整合到受体细胞的染色体DNA上，使目的基因能够维持稳定和表达。=3\*ROMANIII.农杆菌转化法的过程经过的两次拼接、两次导入：第一次拼接：将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上。第二次拼接：插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上（非人工操作）。第一次导入：将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌。第二次导入：含目的基因的T-DNA导入受体细胞（非人工操作）。=4\*ROMANIV.农杆菌转化法的两种具体操作a.可以将新鲜的从叶片上取下的圆形小片(即外植体）与农杆菌共培养，然后筛选转化细胞，并再生成植株；*受体细胞为体细胞。b.可以将花序直接浸没在含有农杆菌的溶液中一段时间，然后培养植株并获得种子，再进行筛选、鉴定等；*受体细胞为受精卵。(2)目的基因导入动物细胞时，受体细胞为受精卵.为什么选择该细胞？受精卵容易表现出全能性。（P82）①常用方法：显微注射法。②将目的基因导入受精卵后，还要经过早期胚胎培养、胚胎移植才能够获得具有新性状的动物。=3\*GB3③获得的动物具有新性状是因为产生了新基因吗？不是。(3)目的基因导入微生物细胞时，常用原核生物作为受体细胞，其中以大肠杆菌最广泛。（P82）①Ca2+处理法（感受态细胞法）的一般过程：先用Ca2＋处理大肠杆菌细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，然后将基因表达载体导入其中。②原核生物的优点（为什么选择原核生物作为受体细胞）。繁殖快、单细胞、遗传物质相对较少、易于培养。=3\*GB3③Ca2+的作用：增加细胞壁的通透性（有的也说是细胞膜）。=4\*GB3④什么是感受态：一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。=5\*GB3⑤以四环素抗性基因为标记基因，可以把表达载体导入具有四环素抗性的大肠杆菌中吗？不能。思考：当真核生物的基因以原核生物作为受体细胞时：1.若无法获得该蛋白，原因可能是什么？真核生物的基因有内含子，原核生物没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制，其初始转录产物中与内含子对应的RNA序列不能被切除，因此无法表达出该蛋白。2.以上情况如何解决？使用cDNA作为目的基因或使用酵母菌等真核生物作为受体细胞。3.若可以获得该蛋白，但是蛋白质无活性，原因可能是？原核生物缺少高尔基体和内质网等细胞器，无法对真核生物的蛋白质进行正确的加工。4.以上情况如何解决？人工体外再加工或使用酵母菌等真核生物作为受体细胞。四、目的基因的检测与鉴定1.标记基因筛选呈阳性一定能确定目的基因导入受体细胞了吗？不一定，导入的还可能是载体自身环化产物、载体-载体连接物。2.因此，针对目的基因仅仅通过标记基因筛选是不够的，还需要进行分子水平的检测和个体生物学水平的鉴定。（P82）3.目的基因的检测与鉴定的目的：（1）检查目的基因进入受体细胞后，是否稳定维持和表达其遗传特性。（2）检查转基因生物是否培育成功。（P82）4．分子水平检测的内容：(1)通过PCR（结合电泳检测）等技术、分子杂交技术检测受体细胞染色体DNA上是否插入了目的基因或检测目的基因是否转录出mRNA。（P82）(2)从转基因生物中提取蛋白质用相应的抗体进行抗原——抗体杂交，检测目的基因是否翻译成了蛋白质。补充了解—抗原-抗体杂交技术从转基因棉花中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原-抗体杂交，若出现杂交带，则目的基因成功翻译出蛋白质。5．个体生物学水平鉴定的内容：表达产物是否具有生物学活性（个体是否具有相应性状）。转基因生物鉴定方法成功标志抗虫植物饲喂害虫（抗虫接种实验）害虫死亡抗病毒（菌）植物病毒（菌）感染（抗病接种实验）未侵染上病斑抗盐植物盐水浇灌正常生长抗除草剂植物喷洒除草剂正常生长获取目的基因产物的转基因生物提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较功能、活性正常补充思考：以上几种方法的顺序是如何的？补充了解—分子杂交技术在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素等作标记，以此作为探针，使探针与基因组DNA或mRNA杂交，若出现杂交带，则目的基因插入成功或转录出mRNA。补充思考：如何利用PCR技术检测受体细胞的染色体DNA上是否插入了目的基因和目的基因是否转录出mRNA？（1）提取受体细胞的DNA，设计一对引物，可以一个与染色体DNA互补结合，另一个引物与目的基因互补结合，这样只有以重组DNA为模板才能获得扩增产物（也可以都跟目的基因互补结合，这样只有含有目的基因，才能获得扩增产物），之后再进行电泳检测；（2）提取受体细胞的mRNA，进行逆转录，获得cDNA，用上述方法进行PCR扩增，之后再进行电泳检测。探究：DNA片段扩增及电泳鉴定（P84）1.利用PCR在体外进行DNA片段扩增的原理（1）PCR利用了DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合，PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器。（2）PCR扩增DNA片段还利用了DNA半保留复制的原理。（3）一次PCR一般要经历30次循环。2.DNA热变性的难易程度跟DNA分子中具有三个氢键的GC碱基对的比例有关，该比例越高，DNA热稳定性越高，越难热变性。3.一般在PCR实验中引物的添加量大于实际所需量。原因：复性时不一定均为引物与DNA模板结合，也存在DNA解开的两条单链的结合。能任意增大添加量吗？不能。4.DNA片段电泳鉴定的原理：（P84）（1）DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷，在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。（2）PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。（3）在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象（迁移速率与之呈负相关）等有关；（4）凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来.5.按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量离心管中依次加入各组分后，要进行离心越10s，目的是：使反应液集中在离心管的底部（混合均匀，提高反应速率）。（P84）6.说出发挥以下作用的工具（1）自动控温，实现DNA的扩增：PCR仪。（2）实际进行PCR反应的场所：微量离心管。（3）向微量离心管转移PCR配方中的液体：微量移液器。（P85）7.PCR时根据目的片段长度适当调整延伸时间。8.预变性条件94℃5min。预变性目的使DNA充分变性，以利于引物更好地和模板结合。（P85）9.配制琼脂糖溶液：根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%-1.2%的琼脂糖溶液。（P85）10.DNA分子通过核酸染料进行染色。11.插入梳子的目的：形成加