酶联免疫吸附实验

酶联免疫吸附实验一、实验目的1、用间接竞争酶联免疫吸附实验（ELISA法）测定多抗血清(pAb)敏感性，从而筛选出融合备用鼠融合前3～5d腹腔注射OTA的计量。2、采用间接ELISA法测定pAb效价，采用阻断ELISA法鉴定pAb敏感性，从而筛选出效价高且IC50（赭曲霉毒素A（OTA）多抗血清对OTA的50%抑制浓度）低的小鼠做细胞融合备用鼠。3、用间接ELISA和间接竞争ELISA筛选出效价高、敏感性好、细胞生长旺盛的杂交瘤细胞株。4、采用间接ELISA法测定单克隆抗体效价，采用阻断ELISA法测定单克隆抗体敏感性，采用间接ELISA检测方法进行单克隆抗体同种型及亚类鉴定。二、实验原理ELISA方法的基本原理是酶分子与抗体或抗体分子共价结合，此种结合不会改变抗体的免疫学特性，也不影响酶的生物学活性。测量时，抗原（抗体）先结合在固相载体上，但仍保留其免疫活性，然后加一种抗体（抗原）与酶结合成的偶联物（标记物），此偶联物仍保留其原免疫活性与酶活性，当偶联物与固相载体上的抗原（抗体）反应结合后，再加上酶的相应底物，即起催化水解或氧化还原反应而呈颜色。其所生成的颜色深浅与欲测的抗原（抗体）含量成正比。这种有色产物可用肉眼、光学显微镜、电子显微镜观察，也可以用分光光度计（酶标仪）加以测定。这样就将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来，使ELISA方法成为一种既特异又敏感的检测方法。ELISA法根据种类和变化可分为以下几类：双抗体夹心法、间接法、竞争法、阻断法双位点一步法、捕获法测IgM抗体、应用亲和素和生物素的ELISA。在本实验中应用了间接法、阻断法和竞争法，利用酶分子与小鼠血液中的抗体共价结合，在底物的作用下，产生颜色反应，通过颜色的深浅筛选出融合备用鼠融合前腹腔注射OTA的计量和效价高且IC50低的小鼠做细胞融合备用鼠。三、实验试剂与器材1、实验试剂在本测定方法中有3种必要的试剂：①固相的抗原或抗体（免疫吸附剂）②酶标记的抗原或抗体（标记物）③酶作用的底物（显色剂）在此实验中所采用的免疫吸附剂是1μg/mLOTA-OVA；标记物是1:1000倍用含5%猪血清的PBST稀释的50μL/孔的GAM-IgG-HRP；显色剂是50μL/孔的TMBOTA、牛血清白蛋白(BSA)、鸡卵清蛋白(OVA)、小鼠单抗同种型检测试剂盒美国Sigma公司；碳化二亚胺(EDC)英国ThermoScientific公司；弗氏完全佐剂(FCA)、弗氏不完全佐剂(FIA)、基础培养基1640、选择培养基HAT、HT、PEG21500美国Invitrogen公司；羊抗鼠酶标二抗(GAM-IgG-HRP)华美生物工程有限公司；实验用水为重蒸去离子水2、实验器材U-3000紫外扫描仪日本岛津公司；550型酶标仪美国Bio-Rad公司；HI9321酸度计美国Hanna公司；AE260电子天平德国Mettler公司；DK-8D电热恒温水槽上海一恒科技有限公司；2-93自动双重纯水蒸馏器、93-3定时恒温双向磁力搅拌器上海亚荣生化仪器厂；1201超净工作台美国FormaScientific公司；DMI3000B倒置生物显微镜德国Leica公司；GS-15R多功能冷冻离心机美国Beckmen公司；3701型CO2培养箱美国Precision公司；96孔、24孔细胞培养板美国Costar公司；96孔酶标板浙江玉环芦蒲塑化器械厂。四、实验步骤1、间接ELISA①加抗原包被→4℃过夜，洗涤三次、抛干②加待检血清→37℃2小时，洗涤三次、抛干③加酶标抗体→37℃2小时，洗涤三次、抛干④加底物液→37℃30分钟，加终止液⑤用ELISA检测仪测定OD值，并计算出P/N比值。以待测孔OD450nm值≥NCOD450nm值的2.1倍(PC/NC≥2.1)，判为阳性。2、竞争ELISA①1μg/mLOTA-OVA包被→4℃过夜，洗涤三次、抛干②加入待检抗原及一定量的酶标抗原（对照孔仅加酶标抗原）→37℃30分钟，洗涤三次、抛干③加底物液→37℃5分钟，加终止液④用ELISA检测仪测定OD值。3、阻断ELISA①100μl1μg/mLOTA-OVA抗原包被→4℃过夜，洗涤三次、抛干②用200μl阻断缓冲液进行封闭→37℃60分钟，洗涤三次、抛干③加OD450nm为1.0左右的小鼠血清50μL和不同浓度的OTA标准品(用乙醇溶解，PBS为稀释液配制)作抑制剂，设NC和BC→37℃15分钟，洗涤三次、抛干④加GAM-IgG-HRP，用封闭液1:1000倍稀释，每孔50μL→37℃30分钟，洗涤三次、抛干⑤加TMB显色液50μL/孔→37℃5分钟，加终止液2mol/LH2SO450μL/孔⑥用ELISA检测仪测定OD450nm值，3个平行求均值，计算结合率。结合率/%=B/B0×100式中：B0为不加OTA的OD450nm值，B为加OTA的OD450nm值。⑦以结合率为纵坐标，以OTA质量浓度的对数值为横坐标，绘制标准曲线，根据曲线趋势推导回归方程，计算OTA多抗血清对OTA的50%抑制浓度(IC50)，以IC50衡量其敏感性。五、实验结果1、筛选出融合备用鼠融合前3～5d应腹腔注射50μg/200μLOTA-BSA2、筛选出效价高且IC50低的3号小鼠做细胞融合备用鼠。3只小鼠血清抗体效价均达到了10－4，说明获得了较好的免疫效果，其中3号鼠血清效价较高。同时由图2可知，3号小鼠的线性回归直线方程为y＝－0.3311x＋0.8685，从方程可以计算出3号小鼠多抗的IC50为12.9ng/mL，均低于其他小鼠。3号小鼠的效价较高且IC50最低，选作细胞融合备用鼠。3、筛选出效价高、抑制效果最好、生长旺盛的1株效果最佳的杂交瘤细胞株为2A11。4、测定出单克隆抗体对OTA的IC50为112.8pg/mL。制备的抗OTA单克隆抗体的亚型为IgG1型。选取最佳包被质量浓度为1μg/mL，最佳抗体工作浓度为1:40000。倍稀释。六、结论单抗亚类为IgG1型，间接ELISA效价1:6.4×105，IC50为112.8pg/mL，亲和常数为9.74×1011L/mol，与赭曲霉毒素B交叉反应率为