《动物细胞工程习题》课件

动物细胞工程习题课程概述1细胞培养了解细胞培养的基本原理和技术，掌握各种细胞培养方法，包括原代细胞培养和细胞株培养。2细胞生物学学习细胞的结构、功能和代谢，掌握细胞生长、增殖、分化和凋亡的机制，以及细胞信号转导和基因表达调控。3动物细胞工程技术深入研究动物细胞工程技术的应用，包括细胞融合、基因工程、抗体工程等技术。细胞培养基的组成基本营养物质氨基酸、维生素、无机盐等，提供细胞生长和代谢所需的营养物质。能量来源葡萄糖、谷氨酰胺等，为细胞提供能量和合成代谢所需物质。生长因子胰岛素、EGF等，促进细胞生长和增殖。缓冲体系碳酸氢钠、HEPES等，维持培养基的pH值稳定。细胞培养基的配制1计算所需成分根据细胞类型和培养目的，计算所需成分的量。2称量溶解将计算好的各种成分称量后，溶解于蒸馏水中。3调节pH值使用酸碱溶液调整培养基的pH值，使其适合细胞生长。4过滤除菌使用0.22μm的滤膜对培养基进行过滤除菌。5分装保存将灭菌后的培养基分装到无菌容器中，并在低温下保存。细胞培养基的灭菌1过滤除菌过滤除菌法是利用细菌无法通过的滤膜，将培养基中的细菌滤除2高温灭菌高温灭菌法是利用高温杀死培养基中的细菌3紫外线灭菌紫外线灭菌法是利用紫外线照射杀灭培养基中的细菌原代细胞培养技术取材从活体组织或器官中获取细胞。消化使用酶或机械方法分离细胞。接种将分离的细胞接种到培养瓶中。培养在合适的培养条件下培养细胞。细胞株培养技术建立稳定的细胞株，可用于生物医药研究病毒、细菌、真菌等微生物培养细胞生长状态的观察和检测动物细胞的生长曲线LagPhase细胞适应环境，生长缓慢LogPhase细胞快速增殖，数量指数增长StationaryPhase细胞增殖速率与死亡速率相等，数量稳定DeclinePhase细胞死亡速率超过增殖速率，数量下降细胞生长相的特点对数生长相细胞以最大的速度生长，分裂频率高，细胞数量呈指数级增长。稳定生长相细胞生长速度减慢，新细胞的生成速率与老细胞死亡速率相等，细胞数量保持稳定。衰退期细胞死亡速度大于新细胞生成速度，细胞数量减少，最终导致细胞群体死亡。细胞活性检测方法显微镜观察观察细胞形态、生长状态，判断细胞是否存活。染色法使用特定染料，区分活细胞和死细胞，例如台盼蓝染色。酶活性检测测量细胞内特定酶活性，反映细胞代谢活性，例如LDH法。MTT法测细胞毒性1原理MTT是一种四唑盐，可以被活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶还原成紫色formazan结晶，formazan的生成量与活细胞数量成正比。2步骤将细胞接种于96孔板，培养后加入MTT溶液，在适当时间后加入DMSO溶解formazan结晶，在酶标仪上测定OD值。3应用MTT法可用于评价药物、毒素、环境污染物等对细胞毒性作用，以及筛选药物，研究细胞凋亡等。CCK-8法测细胞毒性原理CCK-8试剂中的WST-8在电子耦合剂的作用下，被活细胞线粒体中的脱氢酶还原成橙黄色的formazan，其生成量与活细胞数成正比。步骤1.细胞接种2.加入CCK-8试剂3.酶标仪检测吸光度4.计算细胞存活率。优点操作简单，灵敏度高，毒性低，适合高通量筛选。LDH法测细胞毒性原理LDH是存在于细胞质中的酶，细胞损伤或凋亡时，LDH会释放到细胞外。LDH在有NADH存在的情况下，可催化丙酮酸还原成乳酸，并使NADH氧化成NAD+，通过测定NADH的氧化速率来反映LDH的活性，从而间接反映细胞损伤程度。步骤1.细胞培养：按常规方法培养细胞，加入不同浓度的毒性物质处理，设置对照组。2.收集细胞上清液：将处理后的细胞上清液收集，并进行离心处理以去除细胞碎片。3.测定LDH活性：将收集到的细胞上清液加入到含有LDH底物和NADH的反应体系中，在340nm处用酶标仪测定反应液的吸光度变化，即可计算出LDH的活性。细胞凋亡检测方法AnnexinV-FITC/PI法AnnexinV是一种钙依赖性磷脂结合蛋白，可与凋亡细胞暴露于细胞膜外的磷脂酰丝氨酸(PS)结合，而PI则无法穿过完整的细胞膜，但可以进入凋亡晚期或坏死细胞，从而区分不同状态的细胞。TUNEL法TUNEL法利用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)将标记的脱氧核苷酸掺入凋亡细胞的断裂DNA中，从而检测凋亡细胞。Caspase-3活性检测Caspase-3是一种重要的凋亡执行者，其活性可通过特异性底物的荧光或比色法检测。AnnexinV-FITC/PI法AnnexinVAnnexinV是一种钙依赖性磷脂结合蛋白，可与凋亡细胞膜上的磷脂酰丝氨酸（PS）结合。FITC标记AnnexinV被荧光素异硫氰酸盐（FITC）标记，在荧光显微镜下可观察到绿色荧光。PI染色碘化丙啶（PI）是一种核酸染料，可穿透细胞膜，使细胞核发出红色荧光。TUNEL法检测凋亡1原理TUNEL法利用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)将生物素化的dUTP加入到凋亡细胞的DNA断裂处。2应用该方法可用于检测细胞凋亡，并可用于评估药物或治疗的抗凋亡效应。3优势TUNEL法具有灵敏度高、特异性强、操作简便等优点。细胞周期分析方法细胞周期分析方法是研究细胞增殖和凋亡的重要手段。通过分析细胞周期各时相的细胞比例，可以了解细胞的增殖状态和凋亡情况。常用的细胞周期分析方法包括流式细胞术和显微镜观察等。PI法检测细胞周期原理PI是一种可以与细胞核DNA结合的荧光染料，其荧光强度与细胞核DNA含量成正比。通过流式细胞仪检测细胞群中不同DNA含量的细胞比例，可以分析细胞周期的各个阶段。步骤细胞收集细胞固定PI染色流式细胞仪检测细胞转染技术电穿孔法利用电场脉冲改变细胞膜的通透性，使外源基因进入细胞。脂质体法利用脂质体作为载体，将外源基因包裹进入细胞。逆转录病毒法利用逆转录病毒载体，将外源基因整合到宿主细胞基因组中。电穿孔法转染细胞电穿孔利用电脉冲短暂地改变细胞膜的通透性，使外源DNA进入细胞内。细胞类型适用于多种细胞类型，包括细菌、酵母、植物和动物细胞。效率转染效率较高，但可能对细胞造成一定的损伤。步骤包括细胞准备、DNA制备、电穿孔仪器设置和细胞恢复等步骤。脂质体法转染细胞1脂质体包裹将外源基因包裹在脂质体内，形成脂质体-DNA复合物。2细胞摄取脂质体与细胞膜融合，将外源基因送入细胞内。3基因表达外源基因在细胞内表达，发挥生物学功能。逆转录病毒转染法1整合宿主基因组病毒载体将外源基因整合到宿主细胞基因组中2长期表达整合的基因可以长期稳定表达，从而实现持久性的基因治疗3高效转染逆转录病毒具有较高的转染效率，能够有效地将外源基因导入靶细胞基因敲低实验siRNA干扰实验siRNA是由21个核苷酸组成的双链RNA，它可以与靶基因mRNA结合并降解，从而抑制靶基因的表达。shRNA干扰实验shRNA是由19-29个核苷酸组成的短发夹状RNA，它可以被转染到细胞中并表达，从而抑制靶基因的表达。siRNA干扰实验1siRNA的设计与合成根据靶基因序列设计并合成siRNA，确保其特异性并避免脱靶效应。2siRNA的转染选择合适的转染方法将siRNA导入细胞，提高转染效率并降低细胞毒性。3靶基因表达量的检测采用qPCR、Westernblotting等方法检测靶基因的表达量，评估siRNA的干扰效果。4实验结果分析分析siRNA干扰实验结果，得出结论并进行科学解释。shRNA干扰实验shRNA载体shRNA载体是一种基因表达载体，可以将shRNA基因导入细胞，从而实现对靶基因的抑制。干扰机制shRNA通过与靶mRNA结合，诱导靶mRNA降解，从而抑制靶基因的表达。实验结果shRNA干扰实验结果通常通过Westernblot、qPCR或其他方法来验证靶基因的表达水平。细胞免疫学实验细胞因子检测ELISA,流式细胞术等方法检测细胞因子水平，了解细胞免疫反应。细胞毒性实验MTT,CCK-8等方法检测细胞毒性，评估细胞免疫反应的效应。免疫荧光染色使用荧光标记抗体识别细胞表面标志物或细胞内蛋白，观察细胞免疫反应。免疫荧光检测利用特异性抗体标记抗原，在荧光显微镜下观察细胞或组织中抗原的分布和定位。利用荧光染料标记抗体，使抗原发出荧光，从而在显微镜下观察。适用于观察细胞内或组织中特定蛋白的表达、定位和相互