DB3301T 1120-2023 三叶青种质资源鉴定技术规程 SSR标记法

33012023-02-28发布I 3 3 4 6 8本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定1三叶青种质资源鉴定技术规程SSR标记法hemsleyanumDielsetGilg）不同种质资源鉴定的原理、仪器设备及试剂、溶液配制、操作程序及判定方法。本文件适用于三叶青种质资源SSR指纹数据采集及种质GB/T6682—2008分析实验室用水规格和在核酸合成反应时，作为多核苷酸链进行延伸的出发点而起作用的一小段单链脱氧核糖核酸（DeoxyribonucleicAcid，DNA具有所用SSR位点上不同等位变异的品种。参照种质资源用于辅助确定送检样品的等位变异，校正ChainReaction，PCR）扩增及电泳方2e)高速冷冻离心机(最大离心力不小于20000g);f)电子天平(精度为千分之一);5.3所用试剂i)DNA标准分子量标记(marker);3选取三叶青幼嫩叶片，每份样品检测5张叶片的混合样，并设置三4e)重复b)～d),共35个循环；g)4℃保存。7.4PCR产物检测7.4.1.1凝胶准备凝胶制备应按照如下步骤进行：a)将垂直夹心式电泳装置的玻璃板与胶皮套装在一起，取微波炉煮沸后的1%琼脂糖封胶液约5mL封住玻璃板底部的缝隙，制成铸胶槽；合液，超纯水14.8mL,摇匀后加入200μL10%过硫酸铵和12μL四甲基二乙胺(TEMED),搅拌混匀后注满铸胶槽，随即插好样孔梳，于室温下静置直至凝胶完全聚合后使用。去掉封口的琼脂糖胶，将胶板固定于垂直电泳槽中，在电泳槽中加满1×TBE缓冲液，小心抽出样孔梳，用移液器吸取TBE缓冲液冲洗每个点样孔2次，然后向加样孔中点入1.5μLPCR反应产物；同时，在一侧加样孔中加入DNA标准分子量标记(marker)。按样品向正极迁移接通电源，以5V/cm(正负极间距离)恒压电泳约2.5h。电泳完毕后关闭电源，取下玻璃板。小心分开两块玻璃板，取下聚丙烯酰胺凝胶，用蒸馏水冲洗凝胶30s~60s,放入染色液中，轻摇5min~10min进行染色；然后将凝胶从染色液中取出，用蒸馏水快速漂洗2次，每次30s~60s,放入显影液中，轻摇至显色出清晰带纹，取出凝胶用蒸馏水冲洗2遍，沥干后扫描或拍摄成像。7.5数据处理应根据扩增产物的电泳图谱，在相同迁移位置处，有电泳条带记为“1”,无条带记为“0”,生成矩阵。以此来实现电泳带型的数据化，并鉴定参试材料。8判定方法按照由带型数据赋予的数字化指纹，可单独或联合使用的标记鉴定材料材料的异同，具体如下：a)当样品间差异位点数≥2,判定为“不同”;b)当样品间差异位点数=1,判定为“高度相似”;5c)当样品间差异位点数=0，判定为极近似或相同。6A.1DNA提取溶液的配制移至1000mL容量瓶中，用超纯水定容至1000mL，在103.4kPa（121℃)条件下灭菌20mA.1.3三氯甲烷-异戊醇（24:1）A.1.475%乙醇溶液A.3聚丙烯酰胺凝胶电泳溶液的配制至1000mL容量瓶中，用超纯水定容至1A.3.25×TBE缓冲液二胺四乙酸二钠（EDTA）溶液，加入800mL超纯水溶解，调整pH为8.0，转移至1000mL容量瓶中，用量取5×TBE缓冲液200mL于1000mL容量瓶中，用超纯水定容至1000A.3.440%丙烯酰胺溶液分别称取丙烯酰胺190.0g和甲叉双丙烯酰胺10.0g于500mL烧杯中，加7A.4银染溶液的配制量取100mL冰醋酸于1000mL容量瓶中，加超纯水定容至1A.4.2染色液