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DB33porcineepidemicdiazhangchenrrheavirusand浙江省市场监督管理局发布I本标准按照GB/T1.1-2009给请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。1猪流行性腹泻病毒与猪传染性胃肠炎病毒双重荧光定量RT-PCR检测方法本标准规定了猪流行性腹泻病毒（Porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV）和猪传染性胃肠炎病毒（Transmissiblegastroenteritisvirus，TGEV）双重荧光定量RT-PCR检测方法的材料准备、样品采集、核酸提取、荧光定量RT-PCR检测及本标准适用于猪流行性腹泻病毒和猪传染性胃肠炎病毒的核GB/T6682-2008分析实验室用水规格和PBS：磷酸盐缓冲液（PhosphateBufferedSaliPEDV：猪流行性腹泻病毒（PorcineEpidemicDiarrheaVirRNA：核糖核酸（RibonucleicRT-PCR：逆转录聚合酶链式反应（ReverseTranscriptionPolymerTGEV：猪传染性胃肠炎病毒（TransmissibleGastroenteritisVir4试剂和材料水配制中所使用的水应符合GB/T6682-2008分4.2Trizol：RNA抽提试剂，2℃~8℃保存。4.3氯仿：2℃~8℃预冷。4.4异丙醇：2℃~8℃预冷。4.575%乙醇：用新开启的无水乙醇和DEPC水配制，2℃~8℃预冷。4.70.01mol/LPBS，pH7.2：配制方法见附24.11阳性对照：猪流行性腹泻和猪传染性5器材和设备5.2高压灭菌锅。5.6微量移液器。采样及样品前处理过程中应无菌操作，防止样本交叉污3采集的样品密封后，采用保温容器加冰袋或干冰，样品在2℃~8℃条件下保存不应超过24h；若需长期保存，应放置于-80℃冰箱中，且应避免反复可采用核酸提取试剂盒或全自动核酸抽提仪及配套核酸提取试剂进行49.3荧光RT-PCR扩增9.4荧光通道的设定PEDVReportDye设定为FAM，Q阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过阳性对照品“5HEX通道均无Ct值，且无典型扩增曲线。阳性若被检样品FAM通道无Ct值，且无典型的扩增曲线，判为PEDV核酸阴性；若被检样品FAM通道Ct值>36.0，且出现典型“S”型扩增曲线，建议对该样品进行重复试验，重复试验结果Ct值≤38.0且出若被检样品HEX通道无Ct值，且无典型的扩增曲线，判为TGEV核>36.0，且出现典型“S”型扩增曲线，宜对该样品进行重复试验，重复试验结果Ct值≤38.0且出现6A.10.01mol/LPBS（pH7.2）的配制称取磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O)3.0g，磷酸二氢钾（KH2PO4）0.2g，氯化钾（KCl） A.2DEPC水的配制一级水中加入0
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