《犬贾第鞭毛虫实时荧光 PCR 检测方法》

ICS

点击此处添加中国标准文献分类号

团体标准

T/CVMAXXXXX—XXXX

犬贾第鞭毛虫实时荧光PCR检测方法

Real-timePCRassayfordetectionofGiardialambliaindogs.

点击此处添加与国际标准一致性程度的标识

征求意见稿

在提交反馈意见时，请将您知道的相关专利连同支持性文件一并附上。

XXXX-XX-XX发布XXXX-XX-XX实施

中国兽医协会发布

犬贾第鞭毛虫实时荧光PCR检测方法

1范围

本文件规定了犬贾第鞭毛虫实时荧光PCR检测方法的试剂、仪器和耗材、操作步骤、结果判定、实

验室生物安全等技术要求。

本文件适用于犬和猫的粪便中的贾第鞭毛虫核酸的检测。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

GB19489实验室生物安全通用要求

NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范

3术语和定义

本文件没有需要界定的术语和定义。

4试剂

4.1DNA提取试剂

DNA提取试剂采用现成的病毒核酸提取试剂条，或选取商品化的病毒DNA提取试剂盒并参照说明书进

行DNA提取。

4.2已灭菌1×PBS缓冲液

4.3引物探针

4.3.1采用针对犬贾第鞭毛虫的引物及探针：

上游引物GL-F：5'-AATAAATCATAAGACGTCAGGACAACGGTT-3'

下游引物GL-R：5'-AATAAATCATAATTGAGCGGTGTCCG-3'

荧光探针GL-Probe：5'-CCCGCGGCGGTCCTGCTAG-3'

4.3.2使用国家农业行政主管部门批准的其他引物、探针，应对检测程序和判定标准作相应调整。

4.4阴性及阳性对照

阴性及阳性对照的制备方法见附录A。

4.5其他试剂

次氯酸消毒液、2XTaqManFastqPCR预混液、无菌无核酸酶水、1xPBS。

5仪器和耗材

分析天平（感量0.1mg）、高速台式冷冻离心机（最高离心速度不低于12000r/min）、冰盒、实时

荧光PCR仪及配套反应管（板）、-20℃冰箱、可调移液器（2µL，20µL，200µL，1000µL）、1.5mL

离心管（无核酸酶）、自动化核酸提取机。

1

6操作步骤

6.1样品采集及运输

样品采集及运输按照NY/T541的规定执行，采集犬粪便用于检测，样品应在冷藏条件下尽快运输至

实验室，避免反复冻融。采样时应穿戴个人生物安全防护装备，实施现场消毒和废弃物处理。

6.2样品处理

检测前样品应在二级生物安全柜中处理。粪便寄生虫：用无菌拭子蘸取粪便，插入到预先已加入

500~600μl灭菌1xPBS的无菌1.5ml离心管中并转动棉拭子，让PBS更充分的稀释粪便后，将棉拭子抽

出。把装有粪便浑浊液的离心管放入小型离心机中短暂离心，将浑浊液中的固体粪便颗粒离心到管底部

后，用移液枪将沉淀吸出，转移到装有研磨珠的研磨机专用离心管内进行震荡破碎，最后取400μl破碎

完成的粪便沉淀液加入采样管中即可。

6.3样品保存

采集或处理好的样品在2℃～8℃条件下保存应不超过24h；如需长期保存，应放置-20℃冰箱，但应

避免反复冻融（冻融不超过3次）。

6.4寄生虫DNA提取

6.4.1DNA提取应在样本制备区内采用以下方法进行，若使用其他等效的病毒DNA提取试剂，则按照

试剂说明书操作。

6.4.2在已经取好样本的采样管中分别加入20μl蛋白酶K和10μlCarrierRNA，期间每次加样都

用相应规格的移液枪进行反复混匀，按顺序分别在自动核酸提取机的版块上放入采样管、移液枪头、已

标记样本姓名、提取日期、样本类型的核酸收集管后启动程序等待提取完毕即可。*组织类样本试剂条

的使用与以上稍有不同，具体按厂家提供的说明书进行处理。

6.5实时荧光PCR操作

6.5.1在反应混合物配制区、样品制备区和检测区分别进行6.5.2～6.5.4。

6.5.2每个检测反应体系需使用20μL实时荧光PCR反应液。按照八联排每孔12.5μl的2XTaqMan

FastqPCR预混液，0.5μl的上游引物和下游引物和荧光探针Probe，6μl未开封无菌水的量配置，

配置量计算公式：（样本数+阴性对照孔1组+阳性质控孔1组）*2+1~10以内的额外损耗数。

6.5.3充分混匀后分装，每个PCR八联排反应管20μL。转移PCR反应管至PCR加样区。

6.5.4在上述5.6.2的反应管中分别加入5.5中RT的DNA溶液5μL，使每管总体积达到25μL，

记录反应管对应的样品名称。盖紧管盖后，瞬时离心。

6.5.5将5.6.3加样后的反应管放入实时荧光PCR检测仪内，记录反应管摆放顺序。选定5-羧基荧

光素（FAM）作为报告基团，反应参数设置如下：预变性94℃/3min；94℃/5s，60℃/30s，40个

循环；在每次循环的60℃退火延伸时收集荧光。试验结束后，根据收集的Ct值和荧光曲线判定结果。

7结果判定

7.1结果分析条件设定

实时荧光PCR检测阈值设定原则：阈值线超过阴性对照扩增曲线的最高点，且相交于阳性对照扩增

曲线进入指数增长期的拐点，或根据仪器噪声情况进行调整。每个样品反应管内的荧光信号到达设定的

域值时所经历的循环数即为Ct值。

7.2结果描述及判定

当阳性对照Ct值≤28.0且出现典型扩增曲线，阴性对照无Ct值无扩增曲线时，实验成立。当被

2

检样品出现典型的扩增曲线且Ct值≤35.0时，判为犬贾第鞭毛虫核酸阳性；被检样品无Ct值，判为

犬贾第鞭毛虫核酸阴性；对于Ct值＞35.0的样品且出现典型的扩增曲线，应重检，重检仍出现上述

结果的判为弱阳性，否则判为阴性。

8实验室生物安全要求

8.1使用过的实验器材和液体废弃物应先经过次氯酸消毒液喷洒静置擦拭处理，再经高温高压处理后

废弃剩余样品。等固体废弃物应在生物安全柜中密封包装，经表面消毒后移出，再经高温高压处理后废

弃。

3

A

A

附录A

（规范性）

犬贾第鞭毛虫阳性及阴性对照

A.1阳性对照

阳性对照制备方法：人工合成犬贾第鞭毛虫基因片段，将基因连接于pUC57-KAN载体制成阳性质粒。

A.2阴性对照

阴性对照为无菌水。

4

B

B

附录B

（规范性）

实时荧光PCR反应液配方

组分1个检测体系的加入量

2XTaqManFastqPCR预混液12.5μL

上游引物（10μmol/L）0.5μL

下游引物（10μmol/L）0.5μL

荧光探针（10μmol/L）0.5μL

去离子水

6μL

总体积