医学C12-基因功能分析的基本策略

第十二章

基因功能分析的基本策略21世纪的研究热点领域特定基因的功能研究对模式生物的研究基因敲除动物模型，转基因动物模型，基因转染细胞模型，RNA干扰技术基因组功能预测用最大相似得同源基因的功能注释咨询序列用功能相关的保守序列模体进行搜索用直系同源体簇中的已知基因注释未知基因的功能

第一节利用转基因模型研究基因的功能转基因技术是指将外源基因导入受精卵细胞或胚胎干细胞中，通过外源基因与细胞染色体DNA间随机重组的发生而将外源基因导入到受体染色体DNA中，并随着细胞的分离而遗传给后代，以这种方式可以制造转基因动物模型细胞水平的转基因一、利用转基因动物分析特定基因在体内的功能转基因动物是指应用转基因技术培育出的携带外源基因并能稳定遗传的动物，将外源基因整合到动物基因组上，被称为转基因特点分子及细胞水平操作，组织及动物整体水平表达转基因动物的基本过程将改建后的外源基因用注射等方法导入试验动物的受精卵或着床前胚胎干细胞将此受精卵（或着床前胚胎干细胞）植入受体动物的输卵管（或子宫）中发育成携带有外源基因的转基因动物基本方法显微注射法胚胎干细胞法(embryonicstemcells,ES细胞)逆转录病毒感染法精子载体法转基因动物中外源基因的检测染色体及基因水平：斑点杂交、Southern杂交、PCR转录水平：Northern杂交蛋白质水平：Western印迹转基因动物的应用基因特异表达的研究发现基因的新功能发现新基因建立基因表达、调控的动物模型建立人类疾病的动物模型等导入贮藏蛋白基因的超级羊和超级小鼠导入人基因具特殊用途的猪和小鼠超级动物特殊动物转基因动物在医学及生物学领域的应用研究特定基因在体内组织中特异表达或表达时相研究基因在体内的功能是增强某种功能还是导致某种疾病的发生发现基因的新功能或未知基因的功能发现新基因用于只在胚胎期才表达的基因结构和功能的研究建立外源基因表达、调控的动物模型生产人体或动物进行器官或组织移植时所需的器官和组织尚待解决的问题转基因动物的成功率较低。目的基因在宿主染色体的整合及其特异性表达问题。插入突变，破坏宿主基因组功能

外源基因在宿主染色体上整合的拷贝数不等整合的外源基因遗传丢失而导致转基因动物症状的不稳定遗传等产品纯化问题。安全性问题。二、通过在细胞模型中表达特定基因以确定其功能基本程序特定基因的克隆将基因导入细胞使之整合到细胞的染色体DNA中筛选高表达转染基因的细胞第二节利用基因敲除模型研究基因的功能基因敲除指通过DNA同源重组定向地将外源基因插入宿主细胞染色体DNA，从而使特定基因在细胞内或生物活体内失活的过程基因敲除动物是指通过同源重组定向地在活体内剔除特定基因地动物基因敲除小鼠是指特定基因在两条染色体上的等位基因都丧失的小鼠过程：第一阶段是在小鼠胚胎干细胞（ES细胞）水平剔除染色体上的一个等位基因

第二阶段是在小鼠活体内剔除另一个等位基因基因打靶的必备条件胚胎干细胞(ES细胞)能在体外培养，保留发育的全能性打靶载体（基因敲除载体）Neo（新霉素）阳性筛选标志HSV-tk阴性筛选标志：单纯疱疹病毒(herpessimplexvirus)胸腺嘧啶激酶(thymidine

kinase)待剔除基因同源臂序列基因敲除的基本程序打靶载体的构建打靶载体导入ES细胞：重组置换基因敲除ES细胞注射入胚泡胚泡植入假孕小鼠的子宫中嵌合体的杂交育种第三节通过抑制或沉默基因表达对基因的功能进行分析研究在RNA水平上分析基因功能的方法有两种反义RNA封闭mRNA的功能RNA干涉（RNAi)使基因处于沉默状态利用反义RNA抑制基因表达水平反义RNA：指能与mRNA互补配对的RNA分子。5’5’3’3’转录5’3’mRNA正义链反义链反义RNA5’3’应用：根据特定基因的序列设计反义RNA序列，然后通过构建反义RNA转录载体建立转染细胞模型，并研究相应基因表达产物的水平，推测基因功能是否受到干扰，也可以直接合成短的反义RNA并导入细胞中来研究基因的功能，如bcl-2基因的反义RNA治疗B淋巴瘤和白血病反义RNA特点：能与mRNA互补配对，在空间上防碍以此mRNA为模板的蛋白质合成，因而可在翻译水平调控基因表达水平（负调控）利用RNAi技术在细胞中沉默特定基因以研究其功能RNAi技术是指由短双链RNA诱导的同源mRNA的降解过程，可使基因的表达受到抑制RNAi的发现源于两类研究，一类是转基因植物的研究，另一类是反义RNA的研究双链RNA之所以能引起特异性基因抑制，是由于其激活细胞内的一种被称为Dicer的酶复合物所致RNA干扰技术(1998)Nature391,806–811（核酸内切酶和解旋酶）（RNA诱导的沉默复合物）（小干涉性RNA）利用RNAi技术研究特定基因功能的程序确定目标RNA并选择被干涉靶点避开蛋白质结合部位选择目标RNA的AUG下游50～100bp区域的AA(N19)TT或AA(N21)序列，GC比在50％左右，长度在21-23nt，不超过30nt，与其他RNA序列没有同源性准备针对目标RNA的siRNA用siRNA干涉目标RNA合成siRNA

的方法化学合成法，价格昂贵体外转录法，价格便宜，但需避免RNA酶的污染体内转录法合成短双链发夹RNA，易操作siRNA

对目标RNA的干扰siRNA

的转染目标RNA含量或蛋白质表达水平的分析MicroRNA(miRNA)

是近几年在真核生物中发现的一类具有调控功能的非编码

RNA，它们主要参与基因转录后水平的调控。miRNA

的调控功能是十分重要的，近来发现它们在果蝇的细胞增殖、死亡及脂肪代谢，线虫极性的形成，哺乳动物的造血干细胞的分化等过程中起了重要的调控作用。在植物中，miRNA

还参与了叶子与花的发育过程。miRNA

基因的初级转录产物

(pri-miRNA)

在细胞核中被RNase

Ⅲ

Drosha

切割成为前体

miRNA

(pre-miRNA)。胞质中

pre-miRNA

在

Dicer

酶的作用下，被切割成双链的

miRNA：miRNA*

配对分子，成熟的

miRNA

分子被解链，单链的miRNA进入一个核糖蛋白复合体

miRNP

(也叫

RISC(RNA-induced

silencing

complex)

)miRNA

通过与靶基因的3'

UTR

区互补配对，指导

miRNP

复合体对靶基因

mRNA

进行切割或者翻译抑制

动物(尤其是人)

miRNA

的生物合成过程PrecursorofmiRNADicerantisense

miRNAmiRNPLi