《奶牛瘤胃源性乳腺炎诊断标准》

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团体标准

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奶牛瘤胃源性乳腺炎诊断标准

Diagnosticcriteriaofruminaldysbiosis-inducedmastitisondairycows

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XXXX-XX-XX发布XXXX-XX-XX实施

中国兽医协会发布

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奶牛瘤胃源性乳腺炎诊断规范

1范围

本文件规定了奶牛瘤胃源性乳腺炎的定义以及其诊断标准和方法。

本文件适用于牧场兽医、动物诊疗人员和科研人员对奶牛瘤胃源性乳腺炎的诊断。

2规范性引用文件

本文件没有规范性引用文件

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1瘤胃源性乳腺炎Ruminaldysbiosis-inducedmastitis

饲料成分或比例突然变更等应激因素导致奶牛瘤胃内环境失衡，瘤胃菌群、代谢及神经递质紊乱，

有害菌及其代谢物通过作用于上皮细胞、免疫细胞、瘤胃神经等破坏瘤胃屏障，引起瘤胃屏障通透性增

加；有害菌、代谢物和神经递质进一步通过损伤的瘤胃屏障诱导瘤胃及系统性炎症、促进瘤胃内免疫细

胞向乳腺迁移、破坏系统性代谢稳态、激活瘤胃-乳腺介导途径、促使有害菌从瘤胃向乳腺迁移，从而

破坏血乳屏障，导致瘤胃源性乳腺炎。

3.2保定Restraint

通过物理方法或者化学方法限制动物的活动，使其易于进行检查、诊疗等操作，从而保障人畜安全

所采取的措施。

3.3前胃弛缓HypotoniaandAtoniaofForestomaches

是指瘤胃、网胃、瓣胃神经肌肉装置感受性降低，平滑肌自动运动性减弱，内容物运转迟滞所致发

的反刍动物消化障碍综合征。

3.4体细胞数（SCC）

牛奶中的体细胞多数是白细胞，通常由巨噬细胞、淋巴细胞、多形核中性粒细胞和少量的乳腺组织

上皮细胞等组成，约占牛体细胞数的95%，其余是乳腺组织脱落的上皮细胞。通常由每毫升奶含有的体

细胞数目表示，即体细胞数（somaticcellcount,SCC）。

3.5无菌操作

无菌操作是指在医疗护理操作过程中，保持无菌物品、无菌区域不被污染、防止病原微生物入侵机

体的一系列操作技术。

4奶牛瘤胃源性乳腺炎诊断标准

（1）乳汁SCC≥50万个/mL；

（2）瘤胃液pH值<6.0；

（3）纤毛虫活力降低；

（4）血清LPS水平升高；

（5）伴发系统性炎症。

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5奶牛瘤胃源性乳腺炎诊断规范

5.1器械物品的准备

保定绳、加州乳房炎实验（CMT）检测试剂、体温计、听诊器、计时器、pH计、LPS鲎试剂检测试

剂盒、EDTA-抗凝管、采血针、倒胃管、0.1%高锰酸钾溶液、注射器或抽滤器、纱布、液氮罐、-80℃冰

箱、50mL无菌离心管、棉线、MiSeq16S宏基因组测序仪、血常规分析仪。

5.2牛的保定

在牛舍借助颈架，限制牛前后运动，同时采用保定绳将牛的头部固定在颈夹上，头部不要过高。

5.3CMT检测乳中SCC

待检测奶牛四个乳区清洁，擦拭后的乳头必须干净清洁，没有粪渣、药浴液和污水。每个乳区弃掉

头三把奶后挤出2mL被检乳置于乳房炎检验盘，随后加入试剂2mL,缓慢做同心圆状搅拌10s,观察判定（判

定结果参考试剂盒说明书）。以SCC≥50万个/mL为乳腺炎奶牛判定标准。

5.4核对牛的信息

采样前根据登记信息，核对输液牛的耳标号信息，确认无误。

5.5体温检测

体温测量通过体温计检测直肠温度，3min-5min。

5.6心率检测

在安静状态下检查牛的心率。将听诊器放在心脏的听诊部位在左侧胸壁的前下方，肘关节内侧

第3～5肋间位置，记录一分钟内心脏搏动次数。

5.7呼吸频率检测

在安静状态下检查牛的呼吸数。站在牛胸部的前侧方或腹部的后侧方观察，胸腹部的一起一伏是一

次呼吸。计算1分钟的呼吸次数。

5.8奶牛前胃弛缓的诊断

主要判定标准：食欲减退、反刍、嗳气紊乱，胃蠕动减弱或停止，可继发酸中毒。

5.9血常规检测

按照仪器说明书进行。

5.10血液和瘤胃液LPS浓度检测

通过LPS鲎试剂盒进行检测，操作方法按照说明书进行。

6血液采集

待测牛保定，尾静脉采血。具体部位为离尾根10cm左右，第4、5尾椎骨交界中点凹陷处，采血者左

手托起牛尾巴，右手对采血部位消毒后，持一次无菌采血针，右手食指控制针头深度，由下向上垂直刺

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入牛尾腹侧中心线位置约1cm，见有回血即可抽血，一般采3mL即可，拔出采血针，用酒精棉球压一下针

孔防止出血。血液立即转移至无热源ep管中，用于LPS浓度检测。

7瘤胃液收集

7.1收集前的准备

将牛保定。瘤胃导管用0.1%的高锰酸钾浸泡消毒10分钟，随后用清水清洗干净。操作人员要带口罩、

手套，遵守无菌操作。

7.2瘤胃液采集

在奶牛采食2h之后且避免刚刚饮水之后采集瘤胃液样本。把2米长的带过滤头的导胃管送入口腔中，

达咽喉部；待奶牛有吞咽动作时顺势将倒胃管送入至瘤胃；将倒管末端放低或者利用抽滤器或注射器等

抽出导管内空气，使瘤胃液流出；为防止唾液污染，弃去前100mL瘤胃液,再继续收集50mL；收集的瘤胃

液经过4层无菌纱布过滤，收集滤液，放入液氮速冻后放-80℃冰箱保存，用于菌群测序分析。采集完毕

后，导管向地面倾斜，防止拔管过程中采集管里残留的瘤胃液流入气管，随后将导管缓慢抽出，并放置

在盛有蒸馏水的盆中，温水反复换水冲洗导管。

7.3瘤胃液的pH检测

通过倒胃管收集的瘤胃液四层纱布过滤后立即用pH计检测瘤胃液pH值。

7.4瘤胃菌群分析

采用CTAB或SDS方法提取样本基因组DNA，通过琼脂糖凝胶电泳检测DNA纯度和浓度，无菌稀释至

1ng/μL。以稀释的基因组DNA为模板，选择16SV4区引物（515F和806R）、Phusion®High-FidelityPCR

MasterMixwithGCBuffer和高效高保真酶进行PCR。PCR产物用2%浓度的琼脂糖凝胶电泳进行检测，

根据浓度等量混样，混匀后再次通过2%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，并对目的条带回收。随后进行建库，

Qubit和Q-PCR定量，NovaSeq6000进行上机测序。

7.5瘤胃纤毛虫活力检测

新鲜瘤胃液用四层纱布过滤后，滴一滴于干净载玻片上涂成薄层，盖上盖玻片后低倍镜观察10个视

野，计算每个视野中纤毛虫的平均数和有活力的纤毛虫百分数。

8注意事项

8.1按照登记信息，检查所选牛只是否正确；

8.2保定牛应确实，确保人畜安全；

8.3检测SCC时，保证乳区干净且每个乳区弃掉头三把奶。

8.4瘤胃液采集遵守无菌操作，尽量避免环境微生物对瘤胃微生物的污染；

8.5用于检测LPS浓度的血液和瘤胃液样本处理过程中均用无热源管，防止LPS受到污染；

8.6导出瘤胃液过程切记判断导管是否插入瘤胃，避免导管进入气管对牛只造成伤害；