DB12T 843-2018 绿豆源成分检测定性PCR法　　

2018-11-07发布2018-12-01实施I本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由天津市农村工作委员会提出并归口。本标准起草单位：天津市农业质量标准与检测技术研究所、浙江省农业科学院农产品质量标准研究所、天津市东丽区产品质量监督检验所。本标准主要起草人：兰青阔、陈笑芸、王成、赵新、兰璞、王永、王庆平、汪小福、黄凤军、秦志扬。1绿豆源成分检测定性PCR法凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义5.1除非另有说明，仅使用分析纯试剂和重蒸馏水或符合GB/T6682规定的一级水。5.21mol/L氢氧化钠溶液：在160mL水中加入8.0g氢氧化钠(NaOH),溶解后，冷却至室温，再加水定容到200mL。5.3CTAB-Abuffer:将4g十六烷基三甲基溴化胺(CTAB)、16.4g氯化钠(NaC1)、3.15g三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HC1)、1.5g乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2)依次加入到100mL无菌去离子水中，用1mol/L氢氧化钠溶液(见5.1)调pH至8.0,加水定容至200mL。在103.4kPa(121℃)条件下灭菌15min。5.4CTAB-Bbuffer:将1g十六烷基三甲基溴化胺(CTAB)、0.5g氯化钠(NaCl)、依次加入到100mL无菌去离子水中，用1mol/L氢氧化钠溶液(见5.1)调pH至8.0,加水定容至200mL。在103.4kPa(121℃)条件下灭菌15min。2调pH至8.0,加水定容至100mL。在103.4kPa(121℃)条件下灭菌20min。溶解于800mL水中，用盐酸调pH至8.0,加水定容至1000mL。在103.4kPa(121℃)条件下灭菌5.9TE缓冲液(pH8.0):分别量取10mL三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液(见5.7)和2mL乙二胺四乙酸二钠溶液(见5.6),加水定容至1000mL。在103.4kPa(121℃)条件下灭菌20min。5.1110g/L溴化乙锭(EB)溶液：称取1.0g溴化乙锭，溶解于100mL水中，避光保存。溴化乙锭5.1250×TAE缓冲液：称取242.2g三羟甲基氨基甲烷(Tris),先用500mL水加热搅拌溶解后，加入100mL乙二胺四乙酸二钠溶液(见5.6),用冰乙酸调pH至8.0,然后加水定容到1000mL。使5.13加样缓冲液：称取250.0mg溴酚蓝，加入10mL水，在室温下溶解12h;称取250.0mg二甲mL,在4℃下保存。——Mungbean_470bp_F:5'-TGAATGAGAGTGGTGTGAGTGAGA-3——Mungbean_470bp_R:5'-CCGCGAGTATTATTGATGGTAGG-5.18引物溶液：用TE缓冲液(见5.8)或水分别将上述引物稀释到10μmol/L。6仪器6.1分析天平：重感0.1g和0.1mg。6.2PCR扩增仪：升降温速度>1.5℃/s,孔间温度差异<1.0℃。37分析步骤7.1DNA提取buffer,充分混匀；加入20μL蛋白酶K(20mg/mL),充分混匀，65℃水浴1h,间期混匀三次；加入20μLRNaseA(10mg/mL),充分混匀，65℃水浴10min;16000g离心10min;转移上清液至新的2.0mL离心管中，加入500μL三氯甲烷，混匀30s;16000g离心10min;转移500μL上清液至新的2.0mL离心管中，加入500μL三氯甲烷，混匀30s;16000g离心5min,转移上清液至新的2.0mL离心管中，加入2倍体积的CTAB-Bbuffer,吹打混匀，室温静置60min;16000g离心5min,弃上清液；沉淀中加入350μL1.2mmol/LNaCl,再加入350μL三氯甲烷，混匀30s;16000g离心10min,转移上清液至新的洁净2.0mL离心管中；加入0.6倍体积的异丙醇，充分混匀；16000g离心10min,弃上清液；加入500μL70%乙醇，颠倒混匀；16000g离心10min,弃上清液；室温静置至管内水分完全蒸发，加入100μL无菌去离子水溶解沉淀，所得溶液即为绿豆DNA,-20℃贮存备用。7.3PCR扩增7.3.1.1每一个试样PCR反应设置3次重复。7.3.1.2在PCR反应管中按附录B依次加入反应试剂，混匀，再加25μL石蜡油(有热盖设备的PCR仪可不加)。7.3.1.3将PCR管放在离心机上，500g~3000g离心10s,然后取出PCR管，放入PCR仪中。7.3.1.4进行PCR扩增。反应程序为：94℃预变性5min;94℃变性30s,58℃退火30s,72℃延伸30s,共进行35次循环，72℃延伸7min。(可根据仪器和试剂要求对反应参数作适当调整。)7.3.1.5反应结束后取出PCR管，对PCR产物进行电泳检测。7.3.2对照PCR扩增7.3.2.1在试样PCR扩增的同时，应设置阴性对照、阳性对照和空白对照。7.3.2.3除模板外，其余组分与PCR扩增与7.2.1相同。琼脂糖溶液中加入5μLEB溶液，混匀，稍适冷却后，将其倒入电泳板上，插上梳板，室温下凝固合成凝胶后，放入1×TAE缓冲液中，垂直向上轻轻拔去梳板。取12μLPCR产物与3μL加样缓冲液混合后加入凝胶点样孔，同时在其中一个点样空中加入DNA分子量标准，接通电源在2V/cm~5V/泳检测。47.6PCR产物回收7.7PCR产物测序验证8.1PCR扩增产物电泳检测结果——PCR扩增产物电泳检测结果阴性者判为不含绿5DB12/T843—201861GACAAGGAAGCAAAGTAGCAATGATATAAAATGTTCAGA181CTCATACTAGCTCCCCAATTTGTTT241AATTCAATTCTAGATTGTAAGCACTTAAAAAATCAAGAATCTAAGAAAACAAAT301ATGCAACCTCAACTGAAGGTAGTACAAACAGGATTGAGAAAAAGAGAG注：划线部分为Mungbean_470bp_F和Mungbean_