DB12T 653-2016 鲜冻畜、禽肉中动物源性成分的定量检测 实时荧光PCR法　　_第1页
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B45DB12QuantitativePCRmethod天津市市场和质量监督管理委员会发布本标准主要起草人：赵新、易萌、刘娜、兰青阔、刘雪岩、陈锐、朱珠、王成、徐石鲜冻畜、禽肉中动物源性成分的定量检测实时荧光PCR法下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版GB/T6682分析实验室用水规格和实时荧光PCRrealtimePCR鸡源性成分chicken-deriv算试样中种属特异性基因和内参基因的比值，从而对鲜冻畜、禽肉中动物源性成分进行定量检测。Rd1Rd1-P：5′-FAM-CGGCACSus-ACTBSus-P：5′-FAM-TCTGDucg作为试样，装入清洁容器中，加封后，标明标记。将试样于-20℃冷冻保存。SDS裂解液和20μL蛋白酶K（20mg/m缓慢颠倒混匀，12000rpm离心10min，转移上清至一5.3.4.1标准样品和试样实时荧光P进行45次循环扩增反应（95℃变性15s，60℃退火延伸1min在第二阶段的退火延伸（60℃)时段收集荧光信号。4—2.0µL2.0µL—25.0µL—1.0µL1.0µL0.5µL1.0µL—25.0µL情况进行调整。设定阈值处，要求不同浓度梯度标准品的扩增曲线平行，而且同一样品的不同平根据标准溶液的扩增Ct值和初始模板含量的对数间的线性关系，分别绘制动物源性y=x+b(1yb—标准曲线的截距。n—模板靶标浓度a—标准曲线的斜率；b—标准曲线的截距。5.3.5.5.2计算试样中动物源性成分种属特出试样中动物源性成分种属特异性基因百分含量。c—试样中动物源性成分种属特异性基因的百n16SrDNA—内参基因16SrDNA浓度。依照6.1-6.2进行判断；如重复实验动物源性种属特异性基因出现典型扩增曲线，但Ct值仍在36～38内参基因和动物源性种属特异性基因出现典型扩增曲线，但Ct1GTAGGTGCACAGTACGTTCTGAAGCTACTTCTGTGAGGCAGA61GCTGTGTTCCTTGCCGTCATGTGCCCAGGAGACTGGCGGGGAAGGAAGAGACTGGCGGGGAAGGAA61ACAGAGCGAGTCAGAAGGCT注：划线部分为OA-F和OA-R引物序列，方61AGCACACTTAGCCGTGTTCCTTGCACTCTCTGCATATATCCACGGTTCCGCTATG注：划线部分为Chk-F和Chk-R引AAAACTAAAGAATCCCACTAATTAAAA

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