T-HBIQA 0003.6-2024 食品中常见高组胺鱼源性成分检测方法 第6部分：上鱼实时荧光PCR法

T/HBIQAT/HBIQA0003.6—2024食品中常见高组胺鱼源性成分检测方法DetectionofcommonHistamine-richfishderivedingredientinfoodPart6:KatsuwonuspelamisReal-timePCRmethod2024-08-15发布2024-10-15实施河北省检验检疫学会发布T/HBIQA0003-2024《食品中常见高组2本部分适用于食品中鲣鱼源性成分的定性检测。本部分所规定方法的最低检出限（LOD）为0.1%2规范性引用文件GB/T6682分析实验室用水规格和试GB/T27403实验室质量控制规范食品分3.1鲣鱼Scomberjaponicas又俗名炸弹鱼，属鲈形目（Perciformes）、金枪鱼科（Thunnidae）、3.2实时荧光PCRreal-3.3Ct值cyclethreshol4.1PCR：聚合酶链式反应（Polymerasechainreaction）4.2DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonuleicacid）4.3ATP-6：线粒体基因atp合成酶复合物亚基64.4dNTP：脱氧核苷酸三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphat4.5CTAB：十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrithylammoniumbromide）4.6Tris：三（羟甲基）氨基甲烷（tris（hydroxymethyl）aminomethan4.7EDTA：乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic4.8FAM：羧基荧光素（carboxyfluorescei提取样品DNA为模板，以鲣鱼ATP-6基因中相对保守且高度特异的引物和探针进行目标物的实时荧光3因ATP-6基因），），6.9荧光PCR预混液（2×)。）：8检验步骤鱼罐头、鱼肠、鱼丸等食品通常取肉糜300mg，置于三氯甲烷:甲醇:水混4上清液至另一新离心管中，加入0.8倍体积异丙醇，混匀后室温下静置1h。12000r/min离心10备用。也可用等效的商业化DNA提取试剂盒提取样品DNA。取适量DNA溶液原液，使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别测定260nm和28c=A260×N×50··························（1）c——DNA浓度，单位为微克每微升(μg/μLN——核酸稀释倍数。实时荧光PCR反应参数见表2。每个样品各做两个平行管，可先将反应试剂及引物预混成混合液。表2实时荧光PCR反应体系终浓度反应体系/μLF(10μmol/L)1R(10μmol/L)1P(10μmol/L)1DNA模板(50-100ng/μL)——），检验过程中分别设阳性对照、阴性对照和空白对照。以鲣鱼提取的DNA为阳性对照，以已知不含有鲣鱼的样品提取的DNA为阴性对照，以灭菌水为空白对照。样品、阳性对照、阴性对照、空白对照各设置两个平行。5c)阳性对照：有荧光对数增长，且荧光通道出d)内参照：被检样品有荧光对数增长，且荧光通道出现典型的扩增曲线，相应的Ct