氟化嵌段聚合物的应用

II1引言1.1肿瘤治疗概述恶性肿瘤威胁人类的生命。肿瘤会随着身体内细胞的增长和转移发生恶化，最终导致人的死亡。肿瘤的一般治疗方法有手术治疗，主要用于实体瘤病人，许多肿瘤可通过手术切除治疗达到治愈或延长生命的效果；也可以通过应用化学药物来抑制或杀死肿瘤细胞，化疗通常用于全身性治疗，适用于广泛转移或无法通过手术完全切除的肿瘤，还有一些放射治疗等等[1]。传统治疗肿瘤方法虽然在一定程度上可以控制疾病发展，但也存在较大的副作用。研究人员花费了大量的人力物力去研究治疗肿瘤的方案，但是结果都不尽人意。直至近年，研究人员开发了新型的癌症治疗手段——光动力疗法(photodynamictherapy,PDT)。PDT可以产生活性氧杀伤肿瘤细胞，诱导免疫原性细胞死亡[2]。光动力治疗具有许多优点，准确度高，效率高，治疗效果好，副作用低等。PDT仅将光源引导到体内进行治疗，尽可能的避免了手术造成的创伤和痛苦，能较快的使病人恢复[3]。光动力疗法是基于光敏剂、氧气和光源三种物质的相互作用的癌症治疗方法，作为一种安全高效的肿瘤治疗方式,在现代医学领域具有极广阔的应用前景。光动力治疗法的治疗效果取决于肿瘤组织中的氧气含量，但绝大部分实体肿瘤都存在乏氧环境,氧气含量显著低于正常组织,使得光动力治疗的疗效受到了很大的影响[4]。目前大多研究主要通过改善肿瘤微环境缺氧问题提高PDT疗效。1.2肿瘤乏氧环境肿瘤微环境（tumormicroenvironment,TME）是由成纤维细胞、免疫细胞、髓系细胞等多种细胞和物质组成的肿瘤细胞生存的直接环境，与人体正常组织环境有不同的特征[5]。肿瘤乏氧是肿瘤组织关键特征之一，肿瘤细胞及细胞周围没有足够的氧分子，比正常的细胞组织的氧分子浓度低。肿瘤细胞的代谢活动比正常细胞更为活跃，需要更多的氧气供应，但肿瘤内部的血管结构异常，无法有效提供足够的氧气和营养物质[6]，使其自身形成乏氧环境。乏氧微环境导致肿瘤对治疗产生抵抗性，降低PDT的疗效。乏氧环境还能够刺激肿瘤细胞发生变化，以适应乏氧环境，同时可能导致肿瘤细胞改变微环境，加剧肿瘤细胞部位的乏氧问题，进一步导致癌症的恶化。抗肿瘤纳米药物的效果被限制就是因为肿瘤乏氧微环境的存在[7]，导致癌症治疗受到阻碍。1.3含氟聚合物在抗肿瘤活性方面的应用在光动力治疗过程中，肿瘤的缺氧问题成为阻碍治疗效果的关键因素。嵌段聚合物作为一种具有多功能的材料，在抗肿瘤活性研究中展现出与光动力治疗的联合潜力，能有效改善肿瘤缺氧问题[8]。嵌段聚合物在药物传递领域受到广泛关注，其结构可调、生物相容性高、载药能力强以及具备靶向性等特点[9]，使得它能够被设计成为控制药物释放的载体，并实现药物在体内的精准递送。这些优势让嵌段聚合物在抗肿瘤治疗领域具备巨大的应用潜力。含氟聚合物因氟原子的特殊性质——强电负性、范德华半径小和C—F键能高，展现出了双疏性（同时具备疏水性和疏油性）、高化学稳定性和热稳定性以及生物相容性等特性[10]。氟化自组装聚合物的溶氧性使得它能够运输大量氧气，从而有效改善肿瘤的缺氧环境。与单一的光动力治疗相比，这种结合了药物缓解缺氧和光动力治疗的协同治疗方式有望显著提高癌症的治疗效果。综上所述，含氟嵌段聚合物因其独特的结构和性能，在肿瘤治疗领域展现出了良好的应用前景。1.4文章的选题思路和研究方向癌症，作为全球范围内的一大健康难题，给人类的生命与健康带来了沉重的负担。传统的癌症治疗手段，诸如化疗与放疗，尽管在一定程度上能够遏制疾病的进展[11]，但其所存在的局限亦不容忽视。例如，肿瘤细胞在长时间的化疗过程中可能产生耐药性，导致治疗效果大打折扣，这些治疗手段还可能对正常细胞造成损伤，引发一系列副作用，严重影响患者的生活质量。而PDT能有效解决传统癌症治疗手段中的这些问题。PDT中光敏剂在特定波长的光源的照射下,消耗氧气产生毒性活性氧(ROS),从而有效诱导癌细胞凋亡和坏死。激光、光敏剂以及氧气本身都是无害的,所以PDT对于正常组织和细胞都具有较低的毒副作用[12]。肿瘤缺氧微环境导致肿瘤对治疗产生抵抗性，降低PDT的疗效[13]。因此,缓解肿瘤缺氧对于增强光动力治疗疗效具有重要的意义。本实验利用含氟聚合物PEGAF，这种纳米材料凭借其独特性能，能够有效地缓解肿瘤缺氧状态并促进光动力治疗（PDT）的效果。光敏剂通常具有疏水性，因此面临着生物利用度不高以及肿瘤靶向性差的缺点[14]。而含氟聚合物PEGAF的设计巧妙地在其疏水核心中融入了光敏剂Ce6，从而克服了这些缺点。此外，由于该聚合物的氟元素含量高，它展现出了良好的载氧能力，为缓解肿瘤缺氧微环境提供了可靠的解决方案。在实验中，我们利用660nm激光照射，发现Ce6能够高效地生成有毒的单重态氧（1O2），这一过程有效地改善了肿瘤组织的乏氧环境。为了全面评估所制备的氟化聚合物的性能，我们进一步检测了其载氧能力、载药能力以及ROS生成能力。不仅如此，我们还深入探讨了负载了O2和Ce6的氟化聚合物在抗癌方面的潜力，旨在揭示其在癌症中的治疗能力。2实验内容与方法2.1实验相关试剂本实验使用的主要试剂有蒸馏水、75%酒精、青霉素、链霉素、胎牛血清、DMEM培养基、胰蛋白酶、二甲基亚砜（DMEM）、活性氧探针（DCFH-DA）、PBS等。2.2实验相关仪器本实验使用的主要仪器有生物安全柜、细胞培养箱、离心机、激光共聚焦扫描显微镜(CLSM)、荧光分光光度计、便携式溶解氧仪（YSI550A）等。2.3PEGAF中溶氧量的测定由于含氟自组装聚合物作为氧气载体具有高溶氧性的特点。实验中使用携式溶解氧仪进行水溶液中氧浓度的测定。向试剂瓶中通入氮气对10mL的蒸馏水做净化处理。接着在溶液中加入10mgPEGAF，通过通入氧气的方式让其装载氧气，这一过程持续了15分钟。然后将氧探针插入溶液中，用便携式溶氧仪对溶液中的氧浓度连续测量30分钟，观察氧气的变化。设置对照组，比较通入氧气后PEGAF溶液中的含氧量与水和PBS中的含氧量。2.4PEGAF@Ce6的体外活性氧生成能力荧光成像技术相比于传统成像技术灵敏度高、而且操作简单和分辨率高,荧光成像技术是一种基于荧光物质与激发光相互作用产生荧光信号的技术。当荧光物质受到激发光的照射时，它们会吸收激发光的能量，并将其转化为荧光。荧光的波长比激发光的波长更长，因此可以通过检测荧光的波长和强度来获取被检测物体的信息。在荧光成像中，通常使用荧光染料或荧光蛋白等荧光物质来标记被检测物体，然后使用激发光源来照射被检测物体，使荧光物质发出荧光。最后，使用荧光显微镜或其他成像设备来检测荧光的波长和强度，并将其转换为图像信息[15]。本实验中通过荧光光谱技术来评估单线态氧的生成情况。为了深入探究PEGAF纳米颗粒包裹光敏剂Ce6后在溶液环境中单线态氧的产生能力，我们分别将15mg的PEGAF@Ce6和游离态的Ce6加入到3mL的去离子水中。对这些样品进行10分钟的氧化处理，并在此基础上加入了30μM的SOSG溶液。接下来，我们使用强度为0.5W/cm²、波长为660纳米的激光对这些样品进行了10分钟的照射，利用荧光分光光度计，在525nm处（激发波长：504nm）测量了样品的荧光强度，准确地评估了单线态氧的生成情况。2.5细胞的培养本实验要在细胞培养室里准备，在无菌的条件下，把所需的药品和试剂都准备好。先把培养基预热到室温，为了确定是否更换培养液或进行传代，可利用倒置显微镜观察。将冻存的鼠乳腺癌细胞4T1细胞取出后复苏，放入到DMEM培养基（10%（v/v）胎牛血清、100U/mL青霉素和100ug/mL链霉素）中进行培养，轻轻吹匀后离心，制成细胞悬液，接种于DMEM培养皿中，在37℃且含5%的CO2的条件下培养。更换培养液时加入3mL的DMEM即可。进行细胞传代时在培养基中加入胰蛋白酶进行消化，消化时最佳温度是37℃。消化后，传代继续培养等待后续实验。在细胞的培育过程中，我们必须时刻保持培养环境的洁净无菌，这是确保细胞健康生长的关键。任何微小的污染都可能对细胞的生长产生不利影响，因此我们必须严格遵循无菌操作规范，避免任何潜在的污染源。同时，我们还需要定期观察细胞的生长情况，密切关注它们的状态和变化，以便及时调整培养条件，确保细胞能够在最佳的环境中生长和繁殖。并且记录细胞的传代次数和生长情况，以便后续实验使用。2.6PEGAF@Ce6细胞内活性氧的生成能力为了在细胞水平评估单态线氧的生成能力，我们采用了荧光光谱技术，通过荧光光谱使用DCFH-DA为荧光探针。具体操作如下：首先，在1.5mL的细胞悬液中加入含有4μg/mLCe6的PEGAF@Ce6溶液，确保细胞在培养箱中孵育两小时，使纳米颗粒充分与细胞作用。随后，用PBS对细胞进行一次洗涤，再加入1.5mL的DCFH-DA探针继续孵育半小时。完成孵育后，用PBS再次洗涤细胞两次，以去除多余的探针。接下来，用660nm的激光对每个培养皿照射十分钟，以激发荧光反应。最后，通过荧光分光光度计测定细胞在525nm波长处的荧光强度，分析绿色荧光的强度来评估活性氧的生成能力。2.7PEGAF@Ce6细胞内光动力毒性测试为了深入探究PEGAF@Ce6纳米颗粒对肿瘤细胞的毒性效应，我们在此采用了MTT比色法来评估肿瘤细胞存活率。将不同浓度的PEGAF和PEGAF@Ce6纳米颗粒分别加入到含有5%CO2的培养箱中的细胞中，并使其进行孵育。实验分为两组，一组为激光组，另一组为非激光组。在孵育了4个小时后，我们使用660纳米的激光对激光组进行照射，照射时间为10分钟，而非激光组则保持不做任何处理。随后，我们将两组细胞继续孵育培养20个小时，以便充分观察其生长情况。随后，我们在已经处理完毕的细胞中加入了10μL的5mg/mLMTT溶液，以便进一步评估细胞的活性。接下来，将这些细胞置于37℃、含有5%CO2的培养箱中，确保它们能够在适宜的环境下孵育4个小时。孵育完成后，我们轻轻吸出了上清液，以避免对后续实验造成干扰。然后，在每个孔中加入了150μL的二甲基亚砜（DMSO），使其显色。最后，我们使用多功能酶标仪测量了这些细胞在570nm波长处的吸光度。通过比较不同样本之间的吸光度差异，准确地评估PEGAF@Ce6纳米颗粒对细胞活力的影响。这一实验步骤不仅帮助我们了解了纳米颗粒与细胞相互作用的机制，还为后续研究提供了重要的数据支持。3结果与讨论3.1PEGAF的载氧能力由于氟化自组装聚合物作为氧气载体存在着优异的特点，比如说高溶氧性，氟原子的存在使其能运输大量的氧气，有效改善了肿瘤组织中的缺氧环境。通入氮气以排除溶液中溶解的气体，随后通入过量氧气使溶液达到饱和状态。使用便携式溶解氧仪监测了不同溶液中氧浓度的变化，以探究PEGAF的携氧能力及其释放行为（如图1所示）。观察图1，我们可以清晰地看到，即便在1800s的监测时间中，PEGAF仍然能够保持高达18mg/mL的氧浓度。相比之下，对照组的PBS溶液和水中的氧浓度则呈现出不断下降的趋势，最终降至16mg/mL以下。这一对比结果充分表明，与水和PBS相比，PEGAF能够维持更为恒定且较高的氧浓度。综上所述，我们得出结论：PEGAF可以长时间储存氧气，为缺氧肿瘤提供可靠的氧气供应。图1通入氧气后PEGAF溶液中的含氧量与水和PBS中的含氧量对比3.2PEGAF@Ce6纳米颗粒的体外活性氧生成性能评价在实验过程中升高的氧气浓度促进了活性氧的生成，导致了细胞造成大量的损伤，为了检测PEGAF@Ce6产生单线态氧（1O2）的产生能力，并且检测活性氧的产生量，我们在研究过程中使用SOSG和DCFH-DA作为探针来评估。图2不同溶液荧光强度随波长的变化如图2所示，对于不同的波长光线，PEGAF@Ce6产生的荧光强度明显高于Ce6和蒸馏水。在525nm波长处，荧光强度达到了峰值。这充分证明，PEGAF@Ce6纳米颗粒在生成单线态氧方面的能力远胜于Ce6和蒸馏水。3.3PEGAF@Ce6的细胞内ROS生成能力先前的实验已充分验证了溶液中单态氧的产生能力。为了进一步深入了解这一过程中细胞内活性氧的生成情况，我们采用了激光共聚焦显微镜（CLSM）技术。如图3所示，首先，我们利用荧光染料DCFH-DA对细胞进行了染色处理。这种染料具有高度的特异性和灵敏度，能够在细胞内被活性氧氧化后发出明亮的绿色荧光。通过CLSM的观察，我们可以看到第一行中的细胞被DCFH-DA染色，PEGAF@Ce6处理的细胞表现出微弱的绿光，PEGAF@Ce6+L处理的细胞表现出较强的荧光绿，而PBS处理的细胞荧光很暗淡，几乎没有荧光。这直观地反映了细胞内的活性氧浓度。同时，我们利用Hoechst染料对细胞的细胞核进行了染色。这种染料能够特异地与细胞核中的DNA结合，使其呈现出清晰的蓝色轮廓。在CLSM下，我们可以清晰地看到第二行中细胞的细胞核被染成了蓝色，与周围的细胞质形成了鲜明的对比。最后，我们将DCFH-DA和Hoechst两种染色的图像进行了叠加处理，得到了细胞内活性氧分布的综合图像。为了更深入地研究细胞内活性氧的生成量，我们还利用激光共聚焦显微镜捕捉了绿色荧光图像，并制作了荧光强度定量分析图（如图4所示）。通过对比不同处理条件下细胞的荧光强度，我们可以发现，经PEGAF@Ce6处理的细胞在激光照射下呈现出较强的荧光信号，而PBS处理的细胞荧光则相对较弱。荧光强度直接反映了细胞内活性氧生成量的增加。这一现象进一步表明，纳米材料在产生活性氧方面的能力得到了显著提升。根据我们的实验结果，PEGAF@Ce6纳米颗粒在产生活性氧方面的表现明显优于PBS，其生成活性氧的能力更强。这一结果不仅进一步验证了PEGAF@Ce6在细胞内产生活性氧的能力，也为我们后续研究其在光动力治疗中的应用提供了重要的实验依据。图3使用激光共聚焦显微镜拍摄的不同组分处理细胞后的活性氧荧光强度图4使用激光共聚焦显微镜定量分析各组分的荧光强度。3.4PEGAF@Ce6细胞光动力毒性测试在光动力治疗中，活性氧的产生会导致肿瘤细胞死亡。为了验证不同试剂的光动力效应，我们采用了MTT比色法，探究了PEGAF@Ce6纳米颗粒的细胞毒性。首先，我们测试了单独PEGAF对细胞的毒性。实验结果显示，不管是在什么浓度范围内，细胞的存活率依然保持在百分之八十以上，这充分证明了PEGAF本身对细胞的毒性较低。接着，我们进一步测试了PEGAF@Ce6的细胞毒性。实验分为两组进行，一组在有660nm激光照射的条件下进行，另一组则无激光照射。结果显示，在有激光照射的条件下，细胞的存活率相比于无激光照射组有明显的下降。这一发现表明，在激光的激发下，PEGAF@Ce6纳米粒子能够产生更多的活性氧，从而显著增强了光动力治疗的效果，最终导致肿瘤细胞的死亡。综上所述，PEGAF@Ce6纳米粒子在660nm激光照射下产生的活性氧更多，能增强光动力治疗效果，最终导致肿瘤细胞的死亡。图5PEGAF的细胞毒性图6激光和无激光作用下PEGAF@Ce6的细胞毒性4结论在本次实验中，评估了含氟嵌段聚合物PEGAF的载氧能力、载药能力和ROS生成能力。通过便携式溶解氧仪监测比较了PEGAF与水和PBS中的氧的浓度，得出PEGAF可以长时间储存氧气，为缺氧肿瘤提供可靠的氧气供应的结论；通过检测荧光强度比较PEGAF@Ce6、游离Ce6和蒸馏水产生的单态氧的含量，实验表明了PEGAF@Ce6纳米颗粒产生单线态氧的能力比游离Ce6和蒸馏水产生单线态氧的能力强；利用荧光染料探究细胞内ROS的生成含量，实验结果PEGAF@Ce6纳米颗粒产生活性氧的能力强于PBS；最后，通过光动力毒性测试，在660nm激光照射下PEGAF@Ce6纳米粒子产生的活性氧更多，能增强光动力治疗效果，最终导致肿瘤细胞的死亡。综上所述，PEGAF可以包裹Ce6显著增强了光动力治疗效果，此次研究说明了在光动力治疗的过程中氟化嵌段聚合物PEGAF通过包裹氧气和光敏剂，产生的活性氧可缓解乏氧环境的问题，大大提高了肿瘤治疗的效率。这一发现让我们对含氟嵌段聚合物在肿瘤治疗领域的应用前景充满了无限期待，相信未来它将在抗击癌症的战斗中发挥更加重要的作用。参考文献赵印民.具有毒性自由基和改善乏氧微环境的纳米剂在肿瘤治疗中的应用[D].西南大学,2024.张校,任亚丽,王海萍,等.光动力疗法联合免疫检查点抑制剂治疗消化道肿瘤的研究进展[J].胃肠病学和肝病学杂志,2024,33(03):319-323.潘业婷.基于金属有机框架（MOFs）的仿生纳米递送系统的构建及其用于乏氧肿瘤的光动力治疗[D].鲁东大学,2021.许京伦.肝细胞癌肿瘤微环境的分析及其对治疗方法及预后的指导[D].吉林大学,2024.吴朋飞,杨智,李青晏,等.肿瘤微环境中细胞代谢相互作用的研究进展[J].四川大学学报(医学版),2024,55(02):482-489.PetrovaV,Annic