04第四讲-多糖的分离纯化方法

一、多糖提取分离的基本方法原料→前处理→提取→浓缩→沉淀→脱蛋白→脱色、脱脂→干燥→粗多糖第四讲多糖的提取方法1．前处理根据原料的特点，前处量方法不同，一般包括：（1）非极性溶剂处理：脱脂、脱色对植物根、茎、叶、花、果及种子中的多糖，含脂高的应先脱脂，含色素的需进行脱色，通常采用丙酮、乙醚、乙醇进行预处理达到脱脂或脱色的目的。（也可将该操作放在后面）（2）80%乙醇水溶液处理有些原料中含有较多单糖和低聚糖，对多糖的纯度造成影响。由于单糖和低聚糖可溶于热的80%乙醇溶液中，而多糖则不能溶。故可用80%乙醇水溶液除原料中的单糖和低聚糖。2．提取（1）溶剂种类多糖是极性大分子化合物，大多采用不同温度的水、稀碱溶液或氯化钠水溶液作提取溶剂。（2）注意事项①尽量避免在酸性条件下提取，因为酸性条件能引起多糖中糖苷键的断裂。②动物中所含多糖多是酸性多糖，常与蛋白质结合在一起，因此常用碱溶液提取法、中性盐溶液提取法和蛋白酶水解法。③当采用碱溶液提取时，要特别注意前处理，以及温度、pH值的控制。因为碱性溶液中比较容易发生美拉德反应，而美拉德反应一旦发生，所产生的色素极难去除，会对进一步的研究造成无法补救的影响。降低美拉德反应产生程度的方法：通过前处理去除小分子糖、避免pH值处于8-10的范围、避免提取温度处于60-80℃。3．浓缩浓缩操作应在尽量低的温度下进行，并尽量防止提取物与氧气的接触。目的：防止多糖被氧化，保持多糖原有结构及生物活性。

(1)沉淀法

(2)吸附法将干葡聚糖凝胶G25（或吸水棒）加入抽提液中，两者比例为1：5。由于凝胶吸水之故，抽提液的体积可缩小三倍左右，回收多糖约80%。(3)超滤法

超过滤即超滤，自20年代问世后，直至60年代以来发展迅速，很快由实验室规模的分离手段发展成重要的工业单元操作技术。超滤现已成为一种重要的生化实验技术，广泛用于含有各种小分子溶质的各种生物大分子的浓缩、分离和纯化。超滤是一种加压膜分离技术，即在一定的压力下，使小分子溶质和溶剂穿过一定孔径的特制的薄膜，而使大分子溶质不能透过，留在膜的一边，从而使大分子物质得到了部分的纯化。

超滤根据所加的操作压力和所用膜的平均孔径的不同，可分为微孔过滤、超滤和反渗透三种。微孔过滤所用的操作压通常小于4×104Pa，膜的平均孔径为50nm-14μm，用于分离较大的微粒、细菌和污染物等。超滤所用操作压为4×104Pa～7×105Pa，膜的平均孔径为1-10nm，用于分离大分子溶质。反渗透所用的操作压比超滤更大，常达到35×105Pa～140×105Pa，膜的平均孔径最小，一般为1nm以下，用于分离小分子溶质，如海水脱盐，制高纯水等。

超滤技术的优点是操作简便，成本低廉，不需增加任何化学试剂，尤其是超滤技术的实验条件温和，与蒸发、冰冻干燥相比没有相的变化，而且不引起温度、pH的变化，因而可以防止生物大分子的变性、失活和自溶。在生物大分子的制备技术中，超滤主要用于生物大分子的脱盐、脱水和浓缩等。

超滤法也有一定的局限性：它不能直接得到干粉制剂。超滤技术的关键是膜：膜有各种不同的类型和规格，可根据工作的需要来选用。早期的膜是各向同性的均匀膜，即现在常用的微孔薄膜，其孔径通常是0.05mm-1.0mm。近几年来生产了一些各向异性的不对称超滤膜。

常用的膜一般是由乙酸纤维或硝酸纤维或此二者的混合物制成。近年来为适应制药和食品工业上灭菌的需要，发展了非纤维型的各向异性膜，例如聚砜膜、聚砜酰胺膜和聚丙烯腈膜等。这种膜在pH1～14都是稳定的，且能在90℃下正常工作。超滤膜通常是比较稳定的，若使用恰当，能连续用1～2年。暂时不用，可浸在1％甲醛溶液或0.2％叠氮化钠NaN3中保存。

超滤膜的基本性能指标主要有：水通量（cm3/(cm2•h)）；截留率（以百分率％表示）；化学物理稳定性（包括机械强度）等。超滤装置一般由若干超滤组件构成。通常可分为板框式、管式、螺旋卷式和中空纤维式四种主要类型。由于超滤法处理的液体多数是含有水溶性生物大分子、有机胶体、多糖及微生物等。这些物质极易粘附和沉积于膜表面上，造成严重的浓差极化和堵塞，这是超滤法最关键的问题，要克服浓差极化，通常可加大液体流量，加强湍流和加强搅拌。

国外生产超滤膜和超滤装置最有名的厂家是美国的Milipore公司和德国的Sartorius公司。国内主要的研究机构和生产厂家是：中科院生态环境研究中心、杭州淡化和水处理开发中心、兰州膜科学技术研究所、无锡化工研究所、上海医药工业研究所、天津膜分离工程研究所、北京化工厂、常熟膜分离实验厂、无锡市超滤设备厂、无锡纯水设备厂、天津超滤设备厂、湖北沙市水处理设备厂等。从膜的品种，以及从某些研究工作的深度方面看，我国与世畀先进国家的差距不很大，但在膜的质量性能及商品化方面尚有较大差距。

（4）透析法商品透析袋制成管状，其扁平宽度为23mm-50mm不等。为防干裂，出厂时都用10％的甘油处理过，并含有极微量的硫化物、重金属和一些具有紫外吸收的杂质，它们对生物活性物质有害，用前必须除去。可先用50％乙醇煮沸1小时，再依次用50％乙醇、0.01mol/L碳酸氢钠和0.001mol/LEDTA溶液洗涤，最后用蒸馏水冲洗即可使用。实验证明，50％乙醇处理对除去具有紫外吸收的杂质特别有效。使用后的透析袋洗净后可存于4℃蒸馏水中，若长时间不用，可加少量NaN2，以防长菌。洗净凉干的透析袋弯折时易裂口，用时必须仔细检查，不漏时方可重复使用。

新透析袋如不作如上的特殊处理，则可用沸水煮五至十分钟，再用蒸馏水洗净，即可使用。透析进，通常要留三分之一至一半的空间，以防透析过程中，透析的小分子量较大时，袋外的水过量进入袋内将袋涨破。为了加快透析速度，除多次更换透析液外，还可使用磁子搅拌。透析的容器要大一些，可以使用大烧杯、大量筒和塑料桶。小量体积溶液的透析，可在袋内放一截两头烧园的玻璃棒或两端封口的玻璃管，以使透析袋沉入液面以下。

检查透析效果的方法是：用1％BaCl2检查(NH4)2SO4，用1％AgNO3

检查NaCl、KCl等。①把装抽提液的透析袋埋在吸水力强的聚乙二醇（polyetheyleneglycol,分子量20000以上，简称PEG）或甘油中，10ml抽提液可在1小时内浓缩到几乎无水程度。该方法的浓缩速度与透析袋的表面积以及PEG的数量有密切关系。②真空透析浓缩

（5）真空浓缩法（6）冷冻干燥法

4．沉淀常用方法：等电点法（酸性多糖、碱性多糖）、乙醇沉淀法。

5．脱蛋白（1）游离蛋白质的去除方法：

Sevag法、三氟三氯乙烷法、三氯乙酸法、柱色谱法。前三种方法的缺点：操作用到大量有毒有机试剂，对操作者的身体健康造成危害；同时，操作往往要重复十几次才能达到较好的效果，费时费力；最后，操作会造成多糖的大量损失。柱色谱法的优缺点：一次操作既可达到良好效果，但所选择的色谱材料不能对多糖有影响。（2）结合蛋白质的去除结合蛋白常用蛋白酶法去除：链霉菌蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶及胰蛋白酶等处理多糖提取液或多糖粗品，经