微生物生理学幻灯片(第五章)

第五章微生物的氮代谢

一、生物固氮

固氮作用——使氮气作为氮源而利用的过程，是某些原核生物的一种特性。人工固氮——高温高压（300-600℃，200-800atm）生物固氮——固氮酶的参与下进行，常温常压，厌氧条件下。生物固氮的优点：经济（无需投入）；无污染（水体的富营养化、致癌、温室效应、臭氧层的破坏）固氮微生物种类（生态类型）1894年，维诺格拉斯基——巴氏梭菌Beijerinck（贝哲林克）——根瘤菌属、固氮菌属。自生固氮菌——指一类不依赖与它种生物共生而独立进行固氮的微生物。共生固氮菌——指必须与它种生物共生在一起时才能进行固氮的微生物。联合固氮菌——指必须生活在植物根际、叶面或动物肠道等处才能进行固氮的微生物。地球上各种类型的固氮量生物固氮量非生物固氮量固氮类型已固定的氮（×106t/年）固氮类型已固定的氮（×106t/年）生物固氮量175非生物固氮量80其中：农业其中：豆科植物35闪电10非豆科植物燃烧20水稻4其他5工业方面永久草地45化肥生产40森林和林地40工业利用10荒地10海洋36全球固氮作用255×106（一）、研究方法

Ahsby（阿什贝）培养基——无氮培养基进行分离培养判断（不严格、不准确、不精细？）。乙炔还原法——利用固氮酶可以催化乙炔形成乙烯，通过气相色谱仪检测乙烯的形成及量，从而确定固氮酶的存在、活性、活力。同位素示踪法（15N，无放射性）——质谱分光光度计测出。Ahsby无氮培养基甘露醇（蔗糖、葡萄糖）10gKH2PO40.2gMgSO4.7H2O0.2gNaCl0.2gCaSO4.2H2O0.1gCaCO35g蒸馏水1000mL乙炔还原法测定固氮酶活性

实验开始时（时间为0）结果显示无C2H4存在，但随着实验检测过程的继续，C2H4产物增加。

注意：C2H2如何消耗和C2H4是如何增加的过程。如果瓶中含有酶的提取物，条件应该是厌氧，即使固氮酶来源于好氧细菌，也是如此。㈡、生物固氮机理

1、固氮酶2、能量供给（ATP的供应）3、还原力[H]及其传递载体4、固氮酶催化的反应5、固氮酶的防氧保护机制6、固氮产物氨的同化7、固氮酶的调节1、固氮酶固氮酶是一种复合蛋白，由固二氮酶（固氮酶，Dinitrogenase）和固二氮酶还原酶（固氮酶还原酶，Dinitrogenase

reductase）组成。两种（酶）蛋白成分中都含有铁（硫铁蛋白成分），而固氮酶中还含有钼。含有一个钼原子、铁原子（7个？）和硫原子（9个？），是一种小肽，称为铁钼因子（FeMo-co）。N2的还原反应在Fe-Mo中心进行。FeMo-co的成分是MoFe7S9（MoFe7S8）+高柠檬酸，而且每分子固氮酶存在两个FeMo-co。作为固氮酶中的铁钼辅因子FeMo-co的结构图左边部分为与钼相结合的Fe7S8方形体（Fe7S9方形体）。钼又与高柠檬酸上的氧原子相连接，以及固氮酶上的N和S原子相连。每个固氮酶含有两分子的FeMo-co辅助因子固氮酶两个组分的比较比较项目固二氮酶（组分Ⅰ）固二氮酶还原酶（组分Ⅱ）蛋白亚基数4（2大2小）2（相同）相对分子质量22万左右6万左右Fe原子数30（24~32）4不稳态S原子数28（20~32）4Mo原子数20Cys的SH基32~3412活性中心铁钼辅因子（FeMoCo）电子活化中心（Fe4S4）功能络合、活化和还原N2传递电子到组分Ⅰ上对O2敏感性较敏感极敏感特殊说明一些固氮细菌在某些生长条件下能合成无钼的固氮酶，形成所谓互生固氮酶，其不含有钼，而是含有钒（和铁）或只是有铁。当钼充足时，互生固氮酶不能合成，因为含钼固氮酶是细胞中主要的固氮酶，推测互生固氮酶是在环境中缺少钼时仍可进行固氮作用的一种后备酶。2、能量供给（ATP的供应）N三N叁键解离能为940kJ，O2为493kJ。N2：ATP=1：18~24（不成比例），由呼吸、光合磷酸化或厌氧呼吸、发酵作用提供。大约每转移2个e-需要水解4~5个ATP。生物固氮也是一个耗能过程，固定1kg氮化合物要消耗10kg碳水化合物，豆科植物光合作用获得的能量约有5~10%用于固氮。3、还原力[H]及其传递载体固氮反应中所需大量还原力（N：[H]=1：8）必须以NAD（P）H2的形式提供。由各种碳源物质的分解、光合作用的光反应中心Ⅱ使水光解、还原性物质（机体外——连二硫酸钠、丙酮酸等）固氮酶中电子转移的顺序如下：电子供体→固氮酶还原酶→固氮酶→N2→2NH3。电子传递载体有铁氧还蛋白（Fd）或黄素氧还蛋白（Fld）。用于氮还原作用的电子从铁氧还蛋白或黄素蛋白的低电位的铁硫蛋白上转移到固氮酶还原酶上。固氮酶为得到较低的电位也需要ATP，以便N2的还原。固氮酶还原酶的氧化还原电位是-0.30V，而且当电子转移给固氮酶和此酶水解ATP时，电位降低到-0.4V。这种复合体然后与固氮酶相结合，结合后的固氮酶成为还原态，还原态的固氮酶将N2还原成NH3（反应是在FeMo-co中心进行）。虽然将N2还原成NH3只需要6个电子，但实际上在整个反应过程中要消耗8个电子，有两个电子以H2的形式损失掉了。固氮酶的电子供体4、固氮酶催化的反应（6个环节）固氮酶-固氮还原原酶-Mg-ATP复合物——完整的固氮酶。整个固氮过程主要经历以下几个环节：①由Fd或Fld向氧化型固二氮酶还原酶的铁原子提供1个电子，使其还原；②还原型的固二氮酶还原酶与ATP-Mg结合，改变了构象；③固氮酶在“FeMo-co”的Mo位点上与分子氮结合，并与固二氮酶还原酶—Mg-ATP复合物反应，形成一个1：1复合物，即完整的固氮酶；④在固氮酶分子上，有1个电子从固二氮酶还原酶—Mg-ATP复合物转移到固二氮酶的铁原子上，这时固二氮酶还原酶重新转变成氧化态，同时ATP也就水解成ADP+Pi；⑤通过上述过程连续6次的运转，才可使固氮酶释放出2个NH3分子；⑥还原1个N2分子，理论上仅需6个电子，而实际测定却需8个电子，其中2个消耗在产H2上（有关原因尚待进一步研究）。固氮酶催化的反应说明固氮酶除能催化N2→NH3外，还具有催化2H++2e→H2反应的氢化酶活性。当固氮菌在缺N2环境下，其固氮酶可将H+全部还原为H2释放；在有N2环境下，也只是把75％的还原力[H]去还原N2，而把另外25％的[H]以产H2方式浪费掉了。然而，在大多数固氮菌中，还存在另一种经典的氢化酶（hydrogenase），能将被固氮酶浪费了的分子氢重新激活，以回收一部分还原力[H]和ATP。自生固氮菌固氮的生化途径（上）及其细节（下）5、固氮酶的防氧保护机制固氮酶的两个蛋白组分对氧极其敏感——导致失活（固二氮酶还原酶的半衰期为45s，固二氮酶为10min）（厌氧条件）电子传递的要求?已知的大多数固氮微生物都是好氧菌，其生命活动包括生物固氮所需大量能量都是来自好氧呼吸和非循环光合磷酸化——能量的保证。都存在着好氧生化反应（呼吸）和厌氧生化反应（固氮）这两种表面上似乎水火不相容的矛盾过程——矛盾的解决？实际中好氧性固氮菌在长期进化过程中，早已进化出适合在不同条件下保护固氮酶免受氧害的机制了——相应的机制（介绍3种）。①好氧性自生固氮菌的抗氧保护机制呼吸保护——固氮菌科的菌种，呼吸耗氧——低氧状态（微环境——局限空间）构象保护——高氧分压时形成无活性但能防止氧失活的特殊构象——与耐氧蛋白（铁硫蛋白Ⅱ）形成复合物。——维涅兰德固氮菌、褐球固氮菌②蓝细菌固氮酶的抗氧保护机制分化出特殊的还原性异形胞——厚壁、缺乏光合系统Ⅱ、脱氢酶和氢化酶活性高（还原态）、SOD活性高（解除氧毒害作用）、高呼吸强度（2倍）——空间的隔离。非异形胞蓝细菌固氮酶的保护——光合作用和固氮作用的分隔（时间，织线蓝细菌属）、集束状生长（中央处于厌氧环境——失去光合系统Ⅱ，束毛蓝细菌属）、提高过氧化物酶和SOD的活性（除去有毒过氧化合物，粘球蓝细菌属）——时间的隔离。③豆科植物根瘤菌固氮酶的抗氧保护机制侵入根毛→侵入线→皮层→分化膨大变形（不能繁殖）——类菌体（形态变化大，强固氮活性）。具有类菌体周膜——豆血红蛋白（由血红素、球蛋白组成，分别由根瘤菌和植物分别合成，Fe3+→Fe2+）。功能：维持O2在低而恒定的水平，调节类菌体周围的氧浓度，保证向类菌体不断地供应浓度低而流速大的氧（气）流——主要以结合氧存在，从而解决了呼吸强度对ATP的产生和固氮酶的活性的保持之间的矛盾（结合氧：游离氧=10000：1）6、固氮产物氨的同化与相应的酮酸结合形成各种氨基酸注意：①不是直接传递的，而是需要谷氨酸和谷氨酰胺作为载体；②Gln合成酶需要ATP的参与。N2经根瘤菌被植物吸收的过程7、固氮酶的调节固氮作用的抑制剂（能量、电子、固氮酶）：作用于电子的活化和传递阶段（金属螯合剂、巯基化合物、氧化磷酸化和光合磷酸化的解偶联剂等）；作用于底物与酶结合部位——H+、C2H2和N2竞争性抑制（实际上也是固氮酶的作用底物）。①ATP/ADP比率调节ATP/ADP高，固氮酶活性增加；ATP/ADP低，固氮酶活性受到抑制。每催化一个分子氮还原成氨要消耗18-24个分子的ATP，相应地产生了18-24个ADP，从而导致反应系统内ATP／ADP比率的变化。ADP增加，ATP/ADP比率降低，固氮酶活性受到抑制——固氮作用和固氮酶作用对能量的需要。生命需要维持最低生存水平（生存为第一位）。相关实验现象的支持好氧固氮菌在限氧条件下生长时，ATP合成量降低，ATP／ADP比率变小，固氮酶活性降低，向维涅兰德固氮菌的生长培养基补充氧气，机体合成更多的ATP，ATP／ADP比率提高，导致固氮酶活性增加。在进一步的研究中发现好氧固氮菌ATP合成的速率与固氮酶的活性随固氮系统中氧浓度的增加而提高（呼吸作用增强）。说明：在固氮菌或胞外固氮系统中ATP／ADP的比率对固氮酶活性有调节作用。②氨的调节氨效应——当环境中存在氨（NH4+）时，出现固氮作用受到抑制的现象。产生的原因：影响固氮酶的合成还是活性，还是二者兼有。3个实验：证明氨的加入只影响了固氮酶合成，而不直接影响固氮酶的活性（例外：深红红螺菌→失活）。证明氨的加入只影响了固氮酶合成的三个实验A、将有固氮活性的维涅兰德固氮菌、肺炎克氏杆菌和巴氏梭菌等分别放到含铵盐的培养基里培养时，在一定的时间内固氮菌的固氮活性仍然维持在较高的水平上。说明：看不出是否有影响（？只从实验中看是没有影响），但实验中没有考虑铵吸收过程需要时间，到达作用点需要时间，所以实验证据不充分——影响和作用不清。B、在荚膜红假单胞菌和沼泽红假单胞菌培养液里，固氮酶活性在铵盐加入后几分钟内完全被抑制，但经过短时间的迟缓期之后固氮酶活性恢复，迟缓期长短同加入的铵盐量成正比。——说明铵盐可以影响到固氮酶的活性，但无法解释和证明是影响了活性还是酶量；证明氨的加入只影响了固氮酶合成的三个实验进一步实验同时还发现从被铵盐抑制的沼泽红假单胞菌里提取的固氮酶活性仍然存在——活性得以保持，未受影响；另外还发现铵盐加到柱孢鱼腥藻的生长培养基里，细胞内ATP含量立即下降40％。——影响到ATP/ADP，使之下降，从而影响到固氮酶活性（间接作用？）。合理的解释L-谷氨酸+NH4++ATP→L-谷氨酰胺+ADP+Pi对这种现象的解释是由于谷氨酰胺合成酶活性在铵盐加入后临时性增加，造成的现象：①氨吸收加快；②胞内ATP因消耗而含量降低。最终结果：导致胞内ATP／ADP比率降低，从而使固氮酶活性迅速降低。C、铵盐加到以分子氮为唯一氮源的培养基上生长的固氮菌培养液里，培养一段时间导致固氮菌数量增加一倍的同时，单位重量的固氮菌固氮活性与铵盐加入时的固氮活性相比只降低50％。上面的结果说明：铵盐在某些固氮菌里不会影响固氮酶的活性（固氮酶的总量不变——总活性不变，单位菌体的固氮酶活性减少）。证明氨的加入只影响了固氮酶合成的三个实验证明氨的加入只影响了固氮酶合成的3个实验所说明的问题3个实验只作为间接的推测结果；还需要直接结果的证明。铵盐的作用——调节固氮酶合成针对巴氏梭菌——铵盐可以通过调节固氮酶合成的方式调节机体的固氮作用。实验过程：①分别以NH4+、NH4+

+氯霉素和N2作为唯一氮源培养固氮菌；②分别测定其培养得到的固氮菌固定15N2的能力。结果：只有以N2为氮源培养的固氮菌有固氮活性，其他两种氮源培养的固氮菌无固氮活性。结论：说明是铵盐阻遏了固氮酶的合成。——为什么？铵盐的作用——调节固氮酶合成另外通过研究还发现在铵盐耗尽之后，再以N2为氮源培养固氮菌时，短时间内胞内游离氨基酸的量不增加。这可能是由于氨基酸用于固氮酶合成的结果；上面的结果说明：氨的调节作用是通过调节固氮酶的合成来实现的。其它物质对固氮酶的影响在具有硝酸盐还原酶活性的维涅兰德固氮菌里，加入硝酸盐也能使该菌的固氮活性降低50％。硝酸盐加到缺失硝酸盐还原酶的菌株里对固氮活性无影响；——说明什么？另外还发现氨甲酰磷酸在该菌内的浓度受固氮系统中NH4+和ATP的控制。而氨甲酰磷酸的调节作用可归因于ATP／ADP和氨的调节。

NH4++HCO3-→NH2COO-+H2O（非酶促反应）

NH2COO-+ATP→NH2COOPO32-+ADP（Mg2+,氨甲酰磷酸激酶）在研究NH4+的调节作用时发现肺炎克氏杆菌在铵盐浓度高（大于1.5mmol／L）的培养基上生长时，胞内谷氨酰胺合成酶活性低，而谷氨酸脱氢酶活性高（说明什么？）；在铵盐缺乏的培养基上生长时谷氨酰胺合成酶活性高，而谷氨酸脱氢酶活性低。说明：NH4+除了对固氮酶的合成有影响外，也对谷氨酰胺合成酶起作用；谷氨酰胺合成酶在固氮酶合成的调节上起着重要作用——存在同步影响（可能存在内在的联系？）。铵盐存在与否对相关酶的影响NH4+调节固氮酶合成的机理目前一般认为NH4+调节固氮酶合成的机理是：NH4+在谷氨酰胺合成酶催化下与谷氨酸反应生成谷氨酰胺，谷氨酰胺可以和谷氨酰胺合成酶调节基因的产物（一种调节蛋白）相给合导致调节基因产物构型发生变化并结合到谷氨酰胺合成酶的操纵基因上，阻止谷氨酰胺合成酶结构基因的转录，导致谷氨酰胺合成酶不能合成；此时由于没有谷氨酰胺合成酶，催化固氮酶合成的RNA聚合酶不能转录固氮酶的结构基因，固氮酶不能合成。——谷氨酰胺合成酶的作用？NH4+调节固氮酶合成的机理当胞内NH4+缺乏时，谷氨酰胺合成酶调节基因产物无活性，谷氨酰胺合成酶合成，然后它作为一种调节因子结合到固氮酶合成操纵子的启动基因上，启动固氮酶的RNA聚合酶转录，导致固氮酶合成。说明：在铵盐的调节中实际上是谷氨酰胺在起作用（作为固氮酶合成中的调节因子，调节着固氮酶合成操纵子上结构基因的转录）。在肺炎克氏杆菌的谷氨酰胺缺陷型菌株上得到了证实，因为该缺陷型不能合成固氮酶。固氮酶合成调节固氮酶的合成和谷氨酰胺合成酶有关的实验证据增加氨浓度会抑制谷氨酰胺合成酶的合成，同时也影响固氮酶的合成；缺失谷氨酰胺合成酶的谷氨酰胺营养缺陷型菌株，也不能合成固氮酶；将谷氨酰胺合成酶缺陷菌株与带有谷氨酰胺合成酶编码的载体的大肠杆菌进行重组，就可以使谷氨酰胺合成酶缺陷的肺炎克雷伯氏菌株恢复合成固氮酶能力。肺炎克雷伯氏菌的这种重组突变体在通常应受到氨抑制的条件下仍能继续合成谷氨酰胺合成酶，同时也能合成固氮酶。——为什么？氨效应的生理学意义氨和氨甲酰磷酸对固氮酶活性的调节作用，以及从谷氨酰胺合成酶与固氮酶合成的关系来看，它们都是微生物的一种自我调节，以便适应环境的变化。因为既然环境中已有充足的NH4+，那么微生物就不必再消耗能量去合成固氮酶，进行耗能的固氮作用——节能。如果菌株缺乏谷氨酰胺合成酶，不能合成谷氨酰胺，因此固氮菌采用不合成固氮酶，以适应谷氨酰胺合成酶缺陷的特性，对菌体自身进行保护。否则固氮作用合成的氨没有去路，过量的氨就会对固氮菌有毒害作用——保护。氨的“开关”效应在某些固氮菌中，固氮酶的活性也受氨的调节，这种现象称为氨的“开关”效应。在此情况下，过量的氨引起固氮酶还原酶的共价修饰，因而导致酶活性丧失。当氨缺乏时，这类修饰蛋白又转变为活性状态，N2固定反应重新开始进行。因而氨的开关作用是一种通过固氮酶来控制ATP消耗速度而又可逆的方法。——最终的目的是不过度消耗能量，影响到其它生命活动。③钼调节钼是铁钼蛋白与铁钼辅因子的重要组成元素，很明显培养基中钼存在与否也会影响固氮酶的活性与合成。——不能合成（肺炎克雷伯氏菌）或合成无活性的固氮酶（鲍氏织线藻，当加入钼后可以转化有活性的固氮酶）。实验证据（如何证明是何种方式）——固氮活性不受氯霉素抑制，说明钼元素加入后，不是重新合成固氮酶？④氧调节氧能使固氮酶不可逆地失活——确定的结果。氧对固氮酶作用单靠测定固氮酶活性是不充分的，还得说明氧导致酶活性丧失是否有促进了固氮酶的分解和抑制它的合成的过程。用脉冲标记和放射自显影技术测定14C-氨基酸在有氧条件下是否参与固氮酶合成的实验来证明。结果显示固氮酶多肽中有放射性，说明这种氨基酸参与固氮酶合成——寻找参与合成固氮酶的氨基酸来设计实验。将在含NH4+培养基上生长的肺炎克雷伯氏菌接种到无化合态氮的液体培养基时振荡培养（对照为不振荡培养），发现14C-氨基酸插入到固氮酶中的速率比用氧损伤导致蛋白质降解的速率降低得更快。说明：氧阻遏了固氮酶的合成，但氧调节的方式有待进一步研究（不充分）。补充：固氮酶基因（nif）——固氮基因群肺炎克雷伯氏菌是一种研究的较深入清楚的固氮生物，其固氮酶和固氮酶还原酶的是复杂的调控子中的一部分（大量的操纵子）该调控子称为“nif调控子”；肺炎克雷伯氏菌nif调控子全长为24kb，并且含有20个基因排列成几个转录单位。除了固氮酶结构基因外，FeMoCo基因、控制电子转运蛋白的基因以及一系列调节基因亦存在于nif调控子中。固氮酶是由两个亚单位组成的复合蛋白，α亚基(nofD基因产物)和β亚基(nifK基因产物)，每一个亚基都有两个拷贝。固氮酶还原酶是由两个相同亚基组成的蛋白二聚体，是nifH的产物。FeMoCo是由几个基因共同参与合成的，这些基因包括nifN、V、Z、W、E和B。除这些基因外，还有Q基因，用于控制一种产物，此产物涉及到钼的反应过程。nifA基因编码一种正调节蛋白，此调节蛋白激活其他nif基因的转录。肺炎克雷伯氏菌是研究的最清楚的固氮菌

——nif调控子（调节子）的基因结构二、微生物对无机含氮化合物的代谢㈠、无机氮代谢的中心环节——氨的同化㈡、微生物对氨的同化途径㈢、影响氨同化的因素㈠、无机氮代谢的中心环节——氨的同化微生物利用无机氮作为细胞氮源的能力取决于它是否能够将这些无机氮转变为氨。氨的氮原子化学价为-3，与细胞有机物的氮（蛋白质、核酸等）处于同一氧化水平，因此许多微生物能够利用氨以及利用代谢的中间代谢物合成它们所需要的全部氨基酸和其他含氮物，然而微生物所进行的氨同化作用的途径相当少。在微生物细胞所具有的各种氨基酸中，氮只能同化到少数几种氨基酸中，然后再由这些氨基酸作为氨基的供体，通过转氨基作用，将氨基转移给酮酸前体并形成相应的氨基酸。硝酸盐——高度氧化的无机氮源，它可以被许多生物还原，一般分为2类：异化还原作用（NO2-，N2）——反硝化作用；同化还原作用（NH3）。硝酸盐还原酶（2大类）：

异化型——位于细胞膜上，诱导酶，氧可阻遏合成和抑制活性；——厌氧环境

同化型——位于细胞质中，氨阻遏其合成。硝酸盐还原酶实际上是一种多酶复合物，该复合物由脱氢酶、电子传递体和硝酸盐还原酶组成。无机含氮物的代谢途径硝酸盐还原同化还原——硝酸盐被机体逐步还原成氨，然后氨被细胞吸收，用于细胞物质合成。异化还原——硝酸盐被还原成亚硝酸盐，亚硝酸盐或者被分泌到细胞外，或者进一步通过几步反应被还原成分子氮。㈡、微生物对氨的同化途径氨同化作用的可能途径是先合成谷氨酸（或谷氨酰胺）、丙氨酸和天冬氨酸、氨甲酰磷酸，然后由这几种氨基酸作为氨基供体，合成其他氨基酸。主要有5条途径。氨同化的五条途径1、谷氨酸脱氢酶（GDH，有两种：NAD-GDH——分解和NADP-GDH——合成）

α-酮戊二酸+NH4++NADH+H+→L-谷氨酸+NAD+α-酮戊二酸+NH4++NADPH+H+→L-谷氨酸+NADP+2、谷氨酰胺合成酶-谷氨酸合成酶（glnS-gluS）

L-谷氨酸+NH4++ATP→L-谷氨酰胺+ADP+Piα-酮戊二酸+L-谷氨酰胺+NADPH+H+→2L-谷氨酸+NADP+

谷氨酰胺-α-酮戊二酸氨基转移酶（GOG-AT——GlnS）氨的同化作用氨同化的五条途径3、丙氨酸脱氢酶（ADH）丙酮酸+NH4++NADH+H+→L-丙氨酸+NAD+

丙酮酸+NH4++NADPH+H+→L-丙氨酸+NADP+4、天冬氨酸酶（天冬氨酸酶脱氨酶）延胡索酸+NH4+→L-天冬氨酸5、氨甲酰磷酸合成酶

NH4++HCO3-→NH2COO-+H2O（非酶促反应）

NH2COO-+ATP→NH2COOPO32-+ADP（Mg2+,氨甲酰磷酸激酶）注意在各种微生物中，这几个氨基酸都是转氨基酶反应中氨基氮的最活跃的供体。但在许多微生物中，氨同化途径似乎主要是通过先形成谷氨酸，然后再合成其他氨基酸这条途径，不过在有些情况下，一些细菌也可以优先利用合成天冬氨酸这条途径。

㈢、影响氨同化的因素1、培养条件的影响（大肠杆菌等革兰氏阴性细菌）——底物的影响（氢供体的影响）氨、葡萄糖——谷氨酸脱氢酶的活性很高（？）氨基酸混合物——天冬氨酸酶活性高，谷氨酸脱氢酶活性低（？）琥珀酸——谷氨酸脱氢酶和天冬氨酸酶的活力几乎相等（？）2、酶的影响（途径的取向）NAD-GDH——取向于分解（脱氨基作用）NADP-GDH——取向于合成在一些同时具有NADP-GDH和glnS-gluS的微生物中，当氨浓度高时，NADP-GDH起作用，当氨浓度低于1毫摩尔/升时，glnS-gluS途径起作用。三、微生物对有机含氮化合物的代谢㈠、微生物氨基酸代谢概况

㈡、微生物对核酸的分解代谢及其实际应用

㈠、微生物氨基酸代谢概况1、分解及转化（1）氨基酸的脱羧作用（2）氨基酸的脱氨作用（3）氨基酸的转氨基作用

（4）氨基酸消旋作用2、氨基酸的合成（1）氨基酸的脱羧作用脱羧的特点：氨基酸脱羧酶是一类专一性很强的酶；大多数为诱导酶（只有谷氨酸脱羧酶是组成酶）；磷酸吡哆醛是除组氨酸以外的所有氨基酸脱羧酶的辅酶（组氨酸的辅助因子是丙酮酸，而非辅基）；所有氨基酸脱羧酶所催化的反应基本上都是不可逆的。脱羧产物——胺的作用组氨酸——组胺——有降低血压的作用，胃液分泌的刺激剂。酪氨酸——酪胺——有升高血压的作用。赖氨酸——尸胺（H2N-(CH2)5-NH2）鸟氨酸——腐胺（H2N-(CH2)4-NH2）合成多胺化合物的前体——精脒（H2N-(CH2)4-NH-(CH2)3-NH2）、精胺（H2N-(CH2)3-NH-(CH2)4-NH-(CH2)3-NH2，主要存在于真核微生物中），和DNA相结合（小沟内以中和负电荷）。多胺的功能影响蛋白质的合成（大肠杆菌）核糖体的外形会发生显著改变（70S——30S少，50S多）——影响和调节大分子化合物的合成；缺乏时蛋白合成受阻。改变膜的通透性（具有稳定膜结构的功能——缺乏，膜通透性增加）。在发酵后期菌体自溶，氨基酸进一步降解，脱羧后生成胺，有臭味产生，在酶制剂生产过程中，即有这种现象。（2）氨基酸的脱氨作用氨基酸失去氨基而生成α-酮酸的过程称为脱氨基作用①氧化性脱氨基作用

②非氧化性脱氨基作用③氧化-还原脱氨基反应（Stickland反应）

①氧化性脱氨基作用普遍存在于动物、植物及需氧微生物中在酶的催化下，氨基酸在氧化脱氢的同时释放游离氨，这一过程称为氧化脱氨基作用。催化氨基酸氧化脱氨基的酶有两类：

氨基酸氧化酶氨基酸脱氢酶氨基酸氧化酶氨基酸氧化酶为需要的黄素蛋白脱氢酶，以FMN或FAD为辅基，脱下的氢可以直接与分子氧结合生成过氧化氢（不产生ATP？）。在有过氧化氢酶存在时，分解为水和氧。如果没有过氧化氢酶存在时，H2O2能氧化酮酸，使它脱羧生成低一级的脂肪酸，为非专一性酶。氧化性脱氨基作用（氨基酸氧化酶）

氨基酸脱氢酶是一种不直接需要氧的脱氢酶，它们以NAD或NADP为氢载体，脱下的氢不直接交给氧，而是经电子传递链产生水和能量。氨基酸脱氢酶分布极度广，动植物与微生物中都有存在，其中最主要的是谷氨酸脱氢酶（GDH），大多微生物具有两种谷氨酸脱氢酶，即NAD-GDH（分解）和NADP-GDH（合成）。除谷氨酸外，丙氨酸也可以被相应的丙氨酸脱氢酶催化生成丙酮酸、NH3和ATP（？）。芽孢杆菌中丙氨酸脱氢酶分布极广，并且活性较高。从芽孢杆菌中分离到的丙氨酸脱氢酶对NAD+有特异性，它所催化的反应要经过α-亚氨基中间代谢物阶段。在芽孢杆菌中，丙氨酸脱氢酶所催化的反应可能是氨同化作用的主要途径。氧化性脱氨基作用（谷氨酸脱氢酶）氧化性脱氨基作用（丙氨酸脱氢酶）②非氧化性脱氨基作用多存在于厌氧或兼性厌氧微生物中（？）。许多微生物能够进行非氧化性脱氨基作用，其主要作用方式有以下几种：

还原脱氨基反应分解脱氨基反应脱水脱氨基反应脱硫（巯）氢基脱氨基反应还原脱氨基反应严格厌氧，利用氢化酶，使氨基酸加氢脱氨生成饱和脂肪酸和氨（大肠杆菌，甘氨酸——乙酸、NH3）。分解脱氨基反应反应没有氢的交换，而是分子内部发生氢的转移，氨基酸经直接脱氨产生不饱和脂肪酸和氨。（天冬氨酸酶——含氨基酸和低浓度碳水化合物的培养基上，活力最高？，氨同化的逆反应——延胡索酸、NH3）。脱水脱氨基反应丝氨酸和苏氨酸脱氨酶（脱水酶）催化，与天冬氨酸反应相似，除经过β-消去反应移去水，产生亚氨基酸外，也出现分子内氢的转移。其中第三步反应是水与亚氨基的非酶促反应释放氨，5-磷酸吡哆醛是本反应的辅助因子。反应不可逆。脱硫（巯）氢基脱氨基反应半胱氨酸——与脱水脱氨基反应相似，但经β-消去反应移去硫化氢（而不是水），再进行分子重排和脱氨反应，生成α-酮酸和氨，大肠杆菌、枯草杆菌和酵母菌等都能进行这类脱氨基反应，反应不可逆。③氧化-还原脱氨基反应

（Stickland反应）在厌氧梭菌属的一些细菌能够进行某些氨基酸之间的氧化-还原偶联反应，以一种氨基酸作底物脱氢（氢供体）进行氧化脱氨，而以另一种氨基酸作氢受体进行还原脱氨，而实现生物氧化产能的独特发酵类型，称为Stickland反应。Stickland反应速度非常快，同时也由于这一反应过程中能够进行底物水平磷酸化作用，所以梭菌依靠这一反应获得能源。Stickland反应Stickland反应中的氢供体和氢受体反应必须有一对氨基酸参与反应，但并非任意两种氨基酸之间都能进行这种反应。有些氨基酸能优先作为氢供体，而另一些氨基酸则作为氢受体。对于表中来说，一般作为氢供体的氨基酸能够与任何一种氨基酸（氢受体）进行反应。但只有色氨酸和酪氨酸既可作为氢供体，又可以作为氢受体。氢供体氢受体L-丙氨酸L-甘氨酸L-亮氨酸L-脯氨酸L-异亮氨酸L-羟脯氨酸L-缬氨酸L-鸟氨酸L-组氨酸L-精氨酸L-苯丙氨酸L-色氨酸L-色氨酸L-酪氨酸L-酪氨酸L-半胱氨酸L-丝氨酸L-甲硫氨酸（3）氨基酸的转氨基作用转氨酶分布很广，各种酮酸都能替代其相应的氨基酸，供给需要氨基酸的营养缺陷型微生物的生长利用。但这些转氨基反应又不是完全互通的，生物体中有几组转氨酶（称为转氨酶A、B和C组），这几组转氨酶分别只对几组氨基酸有转氨酶活性，而对另外一些氨基酸则没有活性。微生物中的几组转氨酶

微生物中的几组转氨酶

（具有一定的特异性）A组转氨酶——只能够催化该组的任一氨基酸与α-酮戊二酸之间的转氨基作用；B组转氨酶——只催化该组氨基酸和相应酮酸（非固定）之间的转氨基作用；C组转氨酶——催化缬氨酸和丙氨酸之间的转氨基作用。大肠杆菌中α-酮戊二酸和氨基酸之间的转氨基作用氨基酸野生型菌株细胞提取物中转氨酶活性A组转氨酶活性（α-酮戊二酸）B组转氨酶活性（B组相应酮酸）突变种细胞提取物中转氨酶活性异亮氨酸400840缬氨酸370580亮氨酸413（100）3甲硫氨酸31103219苯丙氨酸37442629酪氨酸2525618色氨酸7359072天冬氨酸（100）（100）0（100）注：转氨酶活性按照活力最高的底物来表示，并将活力最高的底物的酶活性定为100。（4）氨基酸消旋作用已知一些D-氨基酸是某些微生物（细菌）细胞壁和荚膜的组成成分，消旋酶在D-氨基酸的生物合成中起着重要作用。芽孢杆菌属的一些菌种的多肽类荚膜以及一些含肽抗生素中也发现有D-氨基酸，所以在这些细菌中氨基酸消旋酶就很重要（？）。2、氨基酸的合成组成蛋白质的20余种氨基酸除可通过转氨基反应合成外；都可以从糖类等物质代谢过程中的几种中间体经一系列的生物化学反应合成。在这些氨基酸合成途径中除赖氨酸在真核生物和原核生物是经不同途径合成外，其余氨基酸合成途径在这两类生物中基本上都是相同的，根据合成氨基酸的前体物质类型，可以将氨基酸生物合成为六组。（1）3-磷酸甘油酸族丝氨酸、半胱氨酸、甘氨酸（2）α-酮戊二酸族氨基酸生物合成（谷氨酸族）谷氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、精氨酸、赖氨酸（真菌）、鸟氨酸（3）草酰乙酸族氨基酸生物合成（天冬氨酸族）天冬氨酸、赖氨酸（细菌）、苏氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺（4）丙酮酸族氨基酸生物合成丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸（5）芳香族氨基酸生物合成（4-磷酸赤藓糖、磷酸烯醇式丙酮酸）酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸（6）组氨酸生物合成（5-磷酸核糖焦磷酸+ATP）组氨酸氨基酸生物合成分组核酸的成分组成核酸（DNA、RNA）核苷酸核苷磷酸碱基戊糖㈡、微生物对核酸的分解代谢及其实际应用核酸是由许多单核苷酸通过3，5-磷酸二酯键连接起来的大分子聚合物。可以通过核酸酶分解利用（营养物质耗尽时），维持生命；核酸不断地更新