第六章-食品与细胞工程

FoodBiotechnology食品生物技术1目录第一章绪论第二章食品与基因工程第三章食品与蛋白质工程第四章食品与酶工程第五章食品与发酵工程第六章食品与细胞工程第七章食品生物工程中的下游过程第八章食品生物技术与食品安全检测第九章生物技术与食品工业“三废”治理2第六章食品与细胞工程第一节概述第二节细胞培养技术第三节细胞融合技术及其应用第四节细胞拆合及其应用第五节动、植物细胞大量培养及应用3第一节概述细胞工程（cellengineering）是生物技术的重要组成部分，它是以生物细胞或组织为研究对象，按照预定目标和设计有计划地改变细胞的遗传物质并使之增殖，从而生产有用的细胞生物产品或获得新型生物品种的一门综合性科学技术。一、细胞工程的定义4从研究水平而言，细胞工程研究层次可分为细胞水平、组织水平、细胞器水平和基因水平。细胞工程研究内容包括：细胞大量培养及控制生长技术、组织培养技术、细胞融合技术、细胞拆合技术、染色体导入技术、胚胎和细胞核移植技术及转基因技术等。细胞工程的核心技术：细胞培养与繁殖目的：获得新性状、新个体、新物质5

二、细胞工程的发展61动物细胞工程的发展78910112植物细胞工程的发展12131415161718192021三、细胞工程的理论基础22细胞学说的建立胚胎学的发展分子生物学的发展2324组织培养的概念组织培养这一名词实际上是一个通用名词，习惯上泛指所有的体外培养。根据培养物的不同可概括为三个不同概念：细胞培养、组织培养和器官培养。25A：细胞培养：将组织块用机械方法或酶解法分离成单个细胞，做成细胞悬液，再培养于固体基质上，成单层细胞生长，或在培养液中呈悬浮状态培养的技术称为细胞培养。26B：组织培养：将活体的一小片组织放在盛有培养液的玻璃或塑料培养器皿中，待组织块粘着后，沿底面平面移动生长的过程称为组织培养。从组织块中生长出来的仍然是细胞，细胞在生长的同时也发生移动，至使组织培养难以长时间维持其原有结构，结果也就成了细胞培养。27C：器官培养：是指采取某些措施使器官的原基、器官的一部分或整个器官在体外存活、生长，并保持其原有结构和功能的培养技术。28体外培养的种类29

生物技术上：生产各种生物技术产品如：狂犬病、小儿麻痹症等病毒疫苗，表皮生长因子及干扰素、白细胞介素等生长因子及单克隆抗体等。科学研究上：在病毒学、免疫学、遗传学、肿瘤学等方面。临床医学上：胎儿的遗传性疾病分析，药物筛选及某些疾病的治疗等。1、细胞培养的现实意义30

1.研究的对象是活细胞

在实验过程中，根据要求可始终保持细胞活力，并可长时间监控、检测甚至定量评估一部分活细胞的情况，包括活细胞的形态、结构、生命活动等。

2、细胞培养的优点31

2.

研究条件可以人为控制

可以根据需要，控制包括pH、温度、氧气、二氧化碳、张力等物理化学的条件，同时，可以施加化学、物理、生物等因素作为条件而进行实验观察，这些因素同样可以处于严格控制之下。323.研究的样本可以达到比较均一性

通过细胞培养一定代数后，所得到的细胞系则可以达到均一性而属于同一类型的细胞，需要时，可采用克隆化等方法使细胞达到纯化。334.研究内容便于观察、检测和记录

采用各种研究技术、记录方法：

研究:倒置生物显微镜、荧光显微镜、电子显微镜、流式细胞术、激光共焦显微镜、免疫组织化学、原位杂交、同位素标记--

记录:摄影照片、缩时电影、电视--345.研究的范围比较广泛

学科多：细胞学、免疫学、肿瘤学、生物化学、遗传学、分子生物学等

对象广：

各种动物：低等动物--高等动物--人类

一种动物：不同年龄--

不同组织--

正常或异常（肿瘤--）

356.研究的费用相对较经济

可提供大量、同一时期、重复性好的、生物学性状相似的实验对象。36

现人工模拟体内环境的技术已经很高,

但,人工所模拟的条件与体内实际情况

仍不完全相同.

当细胞被置于体外培养后,

生活在缺乏动态平衡的环境中,

久了，必然发生变化.3、细胞培养的缺点37

因此，对于体外培养的细胞，应该把他们视作一种既能保持动物体内原细胞一定的性状、结构和功能又具有某些改变的特定的细胞群体，而不能将之与体内的细胞完全等同。38有标准化的工作方法培养用的液体极多（如培养液、胰蛋白酶、HANKS液及抗菌素等），应由专人负责，并保证做到按规程行事，配制浓度准确，灭菌可靠，所有配好的溶液瓶上都要标明名称、浓度、消毒与否和制备日期等。一切培养用品都要有固定的存放点，避免杂乱无章，其中尤其重要的是：培养用品与非培养用品应严格分开，已消毒品与未消毒品应分别存放。4、细胞培养的工作原则39第二节细胞培养技术细胞培养（cellculture）是指动、植物细胞在体外条件下生长、分裂和繁殖，并在培养过程中不再形成组织的一项技术。一、植物细胞培养技术（一）植物细胞培养的发展简史，早在20世纪40年代J.Bonner就报道了银胶菊（Parthenium

hysterophorus）植物组织培养能产生橡胶。20世纪70年代，利用植物细胞培养生产一些药用有效成分在工业上获得了成功。401984年日本的Mitsui石化公司利用紫草的细胞培养生产紫草宁，规模达到750L，产物最终浓度达到1400mg/L。在我国，对于人参中人参皂苷的生物合成研究较为深入。至今，利用植物细胞工程进行天然产物的生产进入了一个新的发展阶段。41离体的植物器官、组织或细胞愈伤组织根芽植物体脱分化再分化脱分化由高度分化的植物器官、组织或细胞产生愈伤组织的过程，称为植物细胞的脱分化。再分化脱分化产生的愈伤组织继续进行培养又可以重新分化成根或芽等器官，这一过程称为植物细胞的再分化。二、植物组织培养植物组织培养过程4243（二）植物细胞工程的理论基础1958年Steward和Shantz

培养了来自胡萝卜根韧皮部的细胞，并成功地经液体振荡培养诱导单个的悬浮细胞发育为成熟的胚胎，并得到了完整的小植株，最终开花结果。首次证明了Haberlandt提出的细胞全能学说（三）培养基目前，已经研制了多种适宜各种植物细胞培养的培养基配方。常用的培养基有MS、B5、White、Heller、ER、Nitsch、NT等，最常用的是MS培养基，目前Sigma等试剂公司已将基本培养基MS商品化。44（四）愈伤组织和悬浮细胞培养技术1、愈伤组织和悬浮细胞的制备，愈伤组织是从外植体的离体材料组织增生的细胞产生的一团不定型的疏散排列的薄壁细胞，诱导愈伤组织的外植体可以采自植物的不同器官，幼嫩的根、茎、叶、花或果实都是诱导愈伤组织的好材料，在有些植物上较老的器官和组织也有产生愈伤组织的能力。2、高表达细胞系的筛选建立为了获得适合大规模工业化生产用的细胞株，高产细胞系的建立与种质保存技术如图6-1所示。45图6-1高产细胞系的建立与种质保存的技术方案46（五）单细胞培养技术1、单细胞分离方法（1）机械法，分离叶肉组织的方法：将叶片轻轻研碎，经过滤和离心，收集和净化细胞。（2）酶法，单细胞分离的酶法指利用果胶酶、纤维素酶处理植物叶片或其他外植体，使细胞分离的方法。

（3）化学法，单细胞分离的化学法指利用一些化学药剂游离细胞的方法。472、单细胞培养方法（1）看护培养看护培养（nursingculture）是用一块活跃生长的愈伤组织来促进培养细胞持续分裂和增殖的方法。（图6-2）看护培养方法的优点是简便易行，效果好。图6-2看护培养程序示意图（2）平板培养平板培养（plantingculture）法的具体操作是将一定细胞密度（通常为l03~l05个细胞/mL）制备好单细胞悬浮液，接种到琼脂培养基上并铺成约1mm左右的薄层固体平板进行培养。

48（3）微室培养微室培养（microculture）是在人工制造的无菌小室中，将一滴悬浮细胞液培养在少量培养基上，使其分裂增殖形成细胞团的方法，见图6-3。图6-3微室培养示意图493、单细胞培养的程序，见图6-4所示图6-4单细胞培养程序示意图（引自周微燕，2001）50（六）提高植物细胞次级代谢产物含量的方法1、加入前体物或诱导物前体物质往往是次生代谢合成途径中的某一中间化合物或是合成的起始物，诱导物（elicitor）是一类能引起植物细胞代谢强度改变或代谢途径改变的物质。2、毛状根和冠瘿瘤培养技术毛状根和冠瘿瘤培养是20世纪80年代发展起来的基因工程和细胞工程相结合的一项技术（见图6-5）。51图6-5由植物器官培养生产次级代谢产物工艺流程图52二、动物细胞培养技术动物细胞培养是从动物体内取出组织或细胞并离散，模拟体内的生理环境，在体外无菌、适温和丰富的营养条件下，使离体细胞或组织生存、生长并维持结构和功能的一门技术。动物细胞（组织）培养技术起源于19世纪所应用的某些胚胎学技术。531997年英国Wilmut领导的小组用体细胞克隆技术克隆出“多利”（Dolly）绵羊。2001年英国又宣布成功培育出世界首批转基因克隆猪。我国在细胞工程一些重要领域的也已经进入世界先进行列，如转基因鱼、试管婴儿、动物体细胞克隆等。20世纪80年代以后，随着细胞生物学、培养系统及培养方法等领域的不断丰富和完善。54

动物细胞培养技术

55动物细胞的培养过程

幼龄动物取动物器官和组织剪碎组织胰蛋白酶处理细胞培养单个细胞动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础56（一）动物细胞培养的特点动物细胞体外培养的一般程序是：从组织取得材料切碎、酶处理、单个细胞培养（原代培养）和扩大培养（传代培养）。体外培养的细胞根据是否贴附于支持物上生长的特性，主要可分为两大类：悬浮型细胞（suspensioncell）和贴附型细胞（adherentcell）。57按照培养细胞的形态，主要有四种类型（见图6-6）：①成纤维细胞型细胞，②上皮细胞型细胞，③游走细胞型细胞，④多形性细胞型细胞图6-6动物细胞形态（a）成纤维细胞型；（b）上皮细胞型；（c）游走细胞型；（d）多形性细胞型（引自鄂征，1995）58（二）、动物细胞培养过程生长曲线生长曲线（gowthcurve）一般分为潜伏期（lagphase）、指数生长期（logphase）、平台期（plateauphase）和衰退期（senescencephase）四个时期（图6-7）。59图6-7每代细胞生长过程示意图60（三）动物细胞培养的基本技术1、无菌条件2、温度3、pH与CO2浓度4、营养物，培养液的成分要包含满足细胞进行糖代谢、脂代谢及核酸代谢所需要的各种营养，如多种必需氨基酸及非必需氨基酸、碳水化合物、维生素、辅酶、核酸、嘌呤、激素、生长因子及无机盐等。用于动物细胞培养的培养基一般可分为天然、合成、无血清培养基几种。目前研制的无血清培养基一般是由基础培养基、生长因子以及激素、基质组成。5、缓冲体系，目前最常用的BSS液是Hanks液、Earle液和PBS液等。61植物组织培养和动物细胞培养的比较比较项目植物组织培养动物细胞培养原理培养基性质培养基特有成分培养结果培养目的细胞的全能性细胞增殖固体培养基液体培养基蔗糖植物激素葡萄糖动物血清植物体细胞株、细胞系快速繁殖、培育无病毒植株获得细胞或细胞分泌蛋白62第三节细胞融合技术及其应用细胞融合（cellfusion），或称为细胞杂交（cellhybrization）是指在外力（自然或人工）作用下，两个或两个以上的异源（种、属间）细胞或原生质体互相接触，不经过有性过程而发生膜融合、胞质融合和核融合并形成一个杂合细胞的现象。63一、细胞融合的方法（一）病毒诱导细胞融合这是最早采用的诱导细胞融合的方法。最常用的是副黏液病毒类，如腮腺炎病毒、新城子鸡瘟病毒、仙台病毒和SV5病毒，在这些病毒中的仙台病毒是最为广泛使用的。64PEG诱导细胞融合的过程大致如下：双亲本细胞→分别制成细胞悬液→混合离心→弃上清→双亲细胞沉淀→加入PEG，水浴（37℃，60s振摇）→细胞凝集、融合→加入37℃无血清培养液，终止作用→离心，弃上清，洗涤细胞→选择性培养基（二）化学诱导细胞融合化学融合（chemicalfusion）是指利用化学融合剂，促使原生质体相互靠近、粘连融合的方法。

65（三）物理诱导细胞融合1、电诱导细胞融合（cellelectrofusion）如图6-8所示。若选择的电压强度和持续时间恰当，则全部细胞或原生质体都会融合。图6-8电融合诱导法原理示意图（罗立新细胞融合技术与应用，2003）66其整个过程如图6-9所示。图6-9电融合诱导细胞融合示意图（http：///emgzf/eppendorf_bionews3/Page6.pdf）2、细胞融合激光诱导法（laserinducedcellfusion）

3、离子束诱导细胞融合法（ionsinducedcellfusion）67二、植物细胞融合（一）原生质体

原生质体指用特殊方法脱去植物细胞壁后而成裸露的、有生活力的原生质团。

植物细胞的原生质体可以从培养的单细胞、愈伤组织和植物器官（种子根、子叶、下胚轴、胚细胞、花粉细胞和嫩叶等）获得。最常用的理想的材料还是植物的叶片。68（二）原生质体的制备1、原生质体的分离（1）材料的消毒处理（2）植物细胞原生质体的分离方法A、机械分离法B、酶解分离法常用的细胞壁降解酶种类：纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、R-10、蜗牛酶等。其中纤维素酶类包括纤维素酶、半纤维素酶、崩溃酶。原生质体制备程序如图6-10所示。692、原生质体的纯化（1）过滤-离心法（2）漂浮法（3）沉降法和漂浮法结合（三）植物细胞融合植物细胞的融合采用PEG法和电融合法比较适用。（四）植物融合子的鉴定70第四节细胞拆合及其应用一、细胞拆合与重组的涵义细胞重组（cellreconstruction）是细胞工程中将细胞融合技术与细胞核、质分离技术结合，即在融合介于诱导下，使胞质体与完整细胞合并，重新构成胞质杂种细胞的过程。71所谓细胞拆合，在细胞工程中主要指核质拆合技术，即用特殊的方法使完整活细胞的细胞核和细胞质分离开来，或把细胞核从细胞质中吸取出来，或用紫外线等把细胞中的核杀死，然后在体外一定条件下将同种或异种的细胞核和细胞质重新组合起来，形成核质杂交细胞，培育出特定形状和功能的细胞或新的个体。72细胞重组的方式：（1）胞质体与完整细胞重组形成细胞质杂交细胞；（2）微细胞与完整细胞重组形成微细胞异核体；（3）胞质体与核体重新组合形成重组细胞。即将除去细胞核后的胞质体与核体重新组合形成重组细胞。这种细胞重组的技术即核移植技术。73核移植技术，它是利用显微镜操作技术将一个细胞的细胞核移植到另一个细胞中，或者将两个细胞的细胞核（或细胞质）进行交换，从而创造无性杂交生物新品种的一项技术。细胞拆合技术中最具有重要意义的是动物细胞核移植工作，我国在鱼类细胞核移植方面的研究处于世界先进水平。74二、细胞拆合的方法细胞拆合技术常可分为物理拆合法和化学拆合法。（一）物理拆合法物理拆合法是用机械的方法或短波光将细胞核去掉（见图6-11）。75A.去核吸管接近透明带B.去核吸管插入透明带并探推卵质膜C.将极体、中期染色体及其周围胞质吸入去核吸管D.退出去核吸管图6-11核移植受体成熟卵去核过程示意图（王蒂，细胞工程学，2003）76（二）化学拆合法细胞松弛素（cytochalasin）最早是从霉菌（Helminthosporium

dematioideum）代谢产物中得到的化合物，具有多种不同的结构，目前已分离纯化出A、B、C、D、E、F、G、H等几种，迄今有关研究大多使用细胞松弛素B（CB），即C29H37NO5。CB对于活细胞具有不寻常的特殊效应，它能阻断细胞质分裂而不干扰细胞核的分裂，引起细胞表面形状的改变，目前常用CB结合离心技术，可将细胞拆分为核体和胞质体，一次处理可得到许多胞质体。77三、各种重组细胞的制备（一）胞质体和核体的制备与融合，图6~12表示离心脱核法。在使用核体进行融合前，可利用核体贴壁粘附性弱的特点，用离心的方法分离纯化核体。（见图6-13）图6-12离心脱核法图6-13胞质体和核体的制备过程示意图（罗立新，细胞工程，2003）78

（二）微细胞的制备与融合当核膜重新形成分别包封一对或几对染色体时，细胞内便许多大小不一的被完整核膜包裹的微核体（micronucleus），用CB结合离心术进行脱核，可分离出大小不同的微细胞（microcell）。79（三）细胞核移植核移植是指利用物理、机械或化学方法将一种细胞的核取出细胞，经分离纯化后，移植到另一种细胞的已去除核的胞质体中，20世纪30年代德国胚胎学家、诺贝尔奖获得者spemnnn首次提出“核移植”的设想：能否将细胞核移植到成熟的去核卵母细胞中进行个体复制，以获得遗传性状与供体细胞一致的后代，但由于技术方面的原因他没能找到将细胞核导入卵细胞的方法。哺乳动物核移植的过程示意图见图6-14。图6-14细胞核移植过程示意图1切开卵母细胞透明带2挤出卵母细胞细胞核3注入供体细胞核4电融合仪融合5培养80细胞器移植技术277次乳腺细胞核移植实验；获得29个发育为8细胞的“胚”；13头代孕母亲；1996年7月5日，羊羔6LL3，被命名为“多莉”。81卵细胞C母绵羊子宫Ａ母绵羊Ｂ母绵羊乳腺细胞细胞质细胞核细胞核移植胚胎移植早期胚胎多莉羊分娩卵裂融合后的卵细胞细胞拆合技术妊娠多莉羊的培育过程无性生殖82克隆羊的成功证明了什么？1、动物体细胞核具有全能性；2、细胞质具有调控细胞核发育的作用。83预想的克隆人技术路线84第五节动、植物细胞大量培养及应用一、植物细胞大规模培养及在食品工业中的应用植物细胞大规模培养的产物有种苗、细胞、初级代谢物、次级代谢物和生物大分子等等。植物细胞大规模培养的具有重大经济价值的应用即为次生代谢产物生产。植物体内的化合物可以分为初生代谢产物和次生代谢产物两大类。初生代谢产物包括淀粉、糖类、脂肪、蛋白质、氨基酸，维生素等，次生代谢产物是一大类无明显生理功能或者非生长发育所必需的小分子有机化合物。85植物细胞大规模培养与微生物细胞发酵类似，一般流程为：86概念：应用组织培养技术，快速繁殖植物（也叫快速繁殖技术）原理：植物细胞的全能性优点：繁殖率高，可大批量生产取材少培养周期短保持优良性状微型繁殖87细胞产物的工厂化生产红豆杉与紫杉醇人参皂甘的生产88它有治疗癌症的强大功效。从红豆杉的树皮和树叶中提炼出来的紫杉醇对多种晚期癌症疗效突出，被称为“治疗癌症的最后一道防线”。红豆杉的根、茎，叶、果都是宝，以红豆杉植株为主要原料提取的紫杉醇，主要用于晚期乳腺癌、晚期卵巢癌、食道癌、鼻咽癌、膀胱癌、淋巴癌、前列腺癌、恶性黑色素瘤和头颈部肿瘤、上胃肠道癌、小细胞性和非小细胞性肺癌的治疗。经验证明，紫杉醇具有独特的抗肿瘤机制和显著的抑制肿瘤的作用。89作物脱毒